某发病猪场链球菌的分离鉴定及药敏试验

张 慧，杨旭兵，董雅琴，刘 爽，吴发兴，李晓成

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266114）

某发病猪场链球菌的分离鉴定及药敏试验

张 慧1，杨旭兵2，董雅琴1，刘 爽1，吴发兴1，李晓成1

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266114）

猪链球菌是一种能感染人和动物的常见病原菌。本实验从山东省某猪场病死猪中分离出两株细菌；通过培养特性观察，革兰染色镜检，特异性基因扩增等一系列分析，确定其为链球菌；进一步进行PCR分型检测，确定其中一株属马链球菌兽疫亚种，另一株为猪链球菌7型。通过药敏试验发现，这两株菌对约95%的常用药物表现出耐药性，仅对链霉素、氯霉素、万古霉素和呋喃妥因较为敏感。

猪链球菌；分离鉴定；药敏试验

猪链球菌病是由致病性链球菌感染引起的急性人兽共患传染病。其主要病原为猪链球菌（Streptococcus suis，SS）和马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp. zooepidemicus，SEZ）。两者均可引起猪脑膜炎、心内膜炎、败血症及关节炎等。SS可致人类出现败血症、心内膜炎、脑膜炎，是一种重要的人兽共患病病原。感染后遗症包括失聪和关节炎。SEZ可以感染多种动物，并可引起感染动物死亡。人类食用被该菌污染的食物或者与患病动物密切接触都可能被感染，主要引发脑膜炎和肾小球肾炎等，严重的甚至导致死亡[1]。

1 材料与方法

1.1 病料

山东省某猪场出生后3 d的仔猪发生急性死亡，死亡前伴有中枢神经症状。剖检发现全身呈败血症症状，脑膜充血，皮下有渗出，个别关节肿胀。采集病死猪脑、心脏、脾脏、肝脏、淋巴结等病料，用于细菌分离鉴定。

1.2 试剂

THB培养基：购自美国BD公司；胎牛血清：购自杭州四季青公司；即用型DL-2000 DNA Marker及PCR Mix试剂盒：购自TAKARA公司；生化鉴定试剂：购自广东环凯微生物科技有限公司；药敏试剂：购自天津金章生物有限公司；电泳琼脂糖：购自上海生工。

1.3 细菌分离培养

1.3.1细菌分离 将采集的组织病料在生物安全柜内无菌接种于含5%胎牛血清的THB固体培养基，37 ℃培养1 d，观察细菌菌落形态；挑取疑似菌落进行液体纯化培养；将液体培养物接种于5%绵羊血琼脂培养基，37 ℃培养1 d 。

1.3.2细菌染色镜检 挑取疑似猪链球菌液体纯培养物涂片，革兰氏染色，显微镜下镜检，观察细菌形态特征。

1.4 生化试验

将新鲜液体培养物分别接种于甘露糖、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、木糖、尿素麦芽糖、甘露醇、水杨苷等，同时做硝酸盐还原试验和触酶试验。

1.5 PCR鉴定

用煮沸方法提取细菌DNA模板。挑取20 h新鲜培养菌落，加入200 μL无菌生理盐水混匀后，在沸水中煮沸10 min；冰浴后4 ℃ 12 000 g离心，取上清液做PCR反应模板。参照邹君等[2]所建立的多重PCR检测方法，采用50 μL体系，在PCR管中依次加入10×PCR Buffer 5 μL、2.5 mmol/μL dNTP 8 μL、25 mmol/μL MgCl26 μL，以及10 μmol/L的引物P1/P2、P7/P8各0.5 μL，P5/P6、P9/P10、P11/P12各0.6 μL，P3/P4各0.8 μL，P13/P14各1.0 μL（表1），模板3 μL，5 U/μL的EX Taq酶2.5 μL，加水补足至50 μL，61 ℃ 30 s退火。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

1.6 药敏试验

按天津金章生物有限公司药敏试剂盒说明书操作，挑取培养20 h的新鲜菌落，调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH肉汤1:1 000稀释后，向每孔加100 μL，密封，孵育20 h后判定结果。

表1 引物序列及其目的片段大小

2 结果

2.1 细菌分离鉴定

从病死猪脑膜中分离到2株细菌（SDF-2、SDF-4）。SDF-2在5%绵羊血平板上呈α溶血；SDF-4呈β溶血（图1）。在含有5%胎牛血清THB平板上，SDF-2呈灰白半透明的小菌落；SDF-4菌落稍大，呈黏液状；涂片镜检结果均为革兰氏阳性链状球菌（图2）。

图1 SDF-4溶血现象

2.2 生化试验

试验结果与SS及SEZ生化特性相符合（表2）。

2.3 PCR检测

图2 SDF-2革兰染色（1 000×）

表2 分离菌的生化反应特性

用多重PCR分型引物，对2株分离菌株同时进行EF-TU、GDH、CPS1I、CPS2J、CPS7H、CPS9H、M-like基因扩增，分别扩增到2株菌的EF-TU基因197 bp、SDF-2 GDH基因943 bp，以及SDF-2的CPS7H基因541 bp、SDF-4的M-like基因1 137 bp。PCR扩增产物片段大小与预期目的片段长度相符（图3）。

图3 分离菌多重PCR扩增电泳结果

2.4 药敏试验

2个分离菌株对呋喃妥因和万古霉素较为敏感，对青霉素、利福平和阿莫西林/棒酸中度敏感，对庆大霉素、头孢噻呋、四环素、磺胺异噁唑等表现出极度耐药（表3）。

表3 分离菌的药敏试验结果

3 讨论

对送检的6头病死仔猪进行猪繁殖与呼吸综合症、圆环病毒病、猪瘟、伪狂犬病和流行性腹泻等病的病原检测，发现均为阴性。从肝脏和淋巴结分离到2株细菌；根据培养特性、染色特点、形态观察，以及生化试验和PCR检测，鉴定为链球菌，从而确诊此猪场发生了链球菌感染。

分离菌株经PCR分型检测，成功分出SS7和SEZ型。SS根据其荚膜多糖抗原性差异，分为33个血清型（1～31、33、1/2），其中1、2、7、9型是猪的致病菌。SS7是除SS2外，在猪场中较为流行的另一种血清型，也可造成猪急性死亡，危害较大[3]。20世纪50—90年代，我国华南、西南和华东等地区曾大范围流行猪链球菌病，其病原均为SEZ；1993年陈永林[4]对我国19个省（直辖市、自治区）采集的126份致病性猪源链球菌进行分群鉴定，发现SEZ占72.22%；刘佩红等[5]1997—1999年从上海市分离到的15株致病性猪源链球菌中，发现C群链球菌有4株。

药敏试验结果表明，链球菌是革兰阳性菌。虽然理论上有很多药物可以进行治疗，但由于抗生素的超剂量使用、滥用，使猪场产生了大量耐药菌株，甚至产生了“超级细菌”。本研究通过药敏试验，筛选出了呋喃妥因、利福平、头孢西丁等药物，并结合猪场实际情况，采取联合用药措施，因而控制了病情发展。因各地区和猪场用药习惯不同，此案例产生的耐药性和之前文献报道也不同[6-7]。这说明猪场在临床用药时，应尽可能按剂量轮换用药、联合用药，不要超剂量用药，以避免产生耐药菌株。

[1] 陆承平. 兽医微生物学[M]. 北京：中国农业出版社，2012：87-88.

[2] 邹君，王楷宬，田莉莉，等. 链球菌猪主要致病种和型多重PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医科学，2011，41（7）：701-706.

[3] 陆承平. 猪链球菌病与猪链球菌2型[J]. 科技导报，2005（9）：9-10.

[4] 陈永林，关孚时. 动物病原性链球菌的血清学分群鉴定[J]. 中国兽医杂志，1993，19（9）：3-4.

[5] 刘佩红，沈素芳，王永康，等. 上海地区猪源链球菌分离株的病原特性鉴定[J]. 中国兽医学报，2001，12（1）：42-46.

[6] 郝春燕，王利勤，王晶钰. 猪链球菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 动物医学进展，2010，31（5）：124-128.

[7] 惠艳华，丁宁，沈莉萍，等. 一例猪链球菌2型感染的病原分离鉴定及药敏试验[J]. 中国动物检疫，2017，34（8）：97-99.

Identification and Antimicrobial Susceptibility Test on Isolates of Streptococcus in a Swine Farm

Zhang Hui1，Yang Xubing2，Dong Yaqin1，Liu Shuang1，Wu Faxing1，Li Xiaocheng1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032，China；2. Qingdao Yebio Biological Engineering Co.，Ltd.，Qingdao，Shandong 266114，China）

Streptococcus suis is a kind of pathogen which could cause Streptococcusis of human and animals. In this study，two strains of bacteria were isolated from dead swine in a swine farm of Shandong Province，and were confirmed as Streptococcus by colony morphology，gram stain and specific gene amplification. By further PCR typing detection，it was ensured that one of the two strains was Streptococcus equi ssp. zooepidemicus，and the other one was Streptococcus suis type 7. By antimicrobial susceptibility test，it was found that the two isolates were resistant to most antibiotics，and were only susceptible to Streptomycin，Chloramphenicol，Vancomycin and Nitrofurantoin.

Streptococcus suis；isolation；antimicrobial susceptibility test

科技部科技基础性专项（2012FY111000）

同等贡献作者：张 慧、杨旭兵

吴发兴、李晓成

S852.65

A

1005-944X（2018）01-0078-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.022

朱迪国）