黄芪多糖诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究

张虹 季有波(通讯作者) 杨琪 孙晓琪 冷雪

130031长春医学高等专科学校临床医学部1

130041吉林大学第二医院骨科医学中心2

130021吉林大学第一医院放射线科3

黄芪多糖诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究

张虹1季有波(通讯作者)2杨琪3孙晓琪1冷雪1

130031长春医学高等专科学校临床医学部1

130041吉林大学第二医院骨科医学中心2

130021吉林大学第一医院放射线科3

目的：探讨黄芪多糖诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。方法：应用形态学观察和流式细胞术等方法对黄芪多糖处理的人乳腺癌细胞进行检测和观察。结果：黄芪多糖处理后48 h细胞具有典型的凋亡细胞形态特征；Western Blot结果显示，黄芪多糖处理后细胞的凋亡标志蛋白PARP降解产物增加。结论：黄芪多糖可以诱导MCF-7细胞凋亡。

黄芪多糖；乳腺癌；细胞凋亡

乳腺癌是女性最常见恶性肿瘤。有学者认为，黄芪多糖可直接杀伤肿瘤细胞[1，2]，并能诱发肿瘤细胞凋亡[3，4]。本研究探讨黄芪多糖诱导人乳腺癌细胞凋亡作用，为黄芪多糖的临床应用提供科学的、客观的理论依据。

资料与方法

细胞培养：人乳腺癌细胞系MCF-7，在含10%胎牛血清(BI)的DMEM培养基，37℃，5%CO2空气及饱和湿度条件下培养。以7×105个细胞接种于6 cm培养皿中培养过夜，次日加入相应浓度的黄芪多糖。

试验分组：①试验组：黄芪多糖用量0.75 mg/mL、1.5 mg/mL、3 mg/mL。②对照组：阿霉素组0.1 μmol/L及空白对照。

试剂：黄芪多糖为天津赛诺制药有限公司产品；DMEM培养基、PI、胰蛋白酶购自ThermoFisher；四甲基偶氮唑盐(MTT)、RNase购自 Sigma；DMSO 购自Amresco；苏木精、伊红和姬姆萨染液等。

试验方法：①光镜形态学观察：将细胞以2×105个/孔接种于含盖玻片的6孔板中，培养48 h后，试验组加入含0.75、1.5、3mg/mL黄芪多糖的培养液，阴性对照组仅加培养液，每孔内液体终体积为1.5 mL。培养72 h后，取出盖玻片，常规HE染色，高倍显微镜下计算5个不同视野的阳性细胞百分比，然后计算出平均值作为该标本的阳性细胞百分比。②Western Blot检测凋亡标志物PARP降解产物(cleaved-PARP)：细胞经黄芪多糖处理后48 h，收集细胞，加入200 μL含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上作用30 min，14 000 rpm离心15 min，收集上清液。BCA方法测蛋白浓度。利用SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白分离并通过电场将蛋白质转移到PVDF膜上，PVDF膜于室温置于含5%去脂奶粉的PBS-TWEEN溶液中封闭1 h，然后于4℃冰箱中将PVDF膜与抗PARP抗体孵育过夜；用PBS-TWEEN溶液洗膜3次，5 min/次；于室温将PVDF膜与二抗孵育1 h，用PBS-TWEEN溶液洗膜3次。用ECL发光液曝光与抗体结合的蛋白条带。③Ac-DEVD-CHO对黄芪多糖诱导的细胞凋亡的影响：将细胞以3×103个/孔接种于96孔板，培养24 h后，试验组先加入1 mg/mL的Ac-DEVD-CHO；对照组和空白组加入培养液。每组各设4个平行孔，培养1 h后，试验组加入含1.5 mg/mL、3 mg/mL黄芪多糖的培养液，每孔内液体终体积为100 μL。培养72 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，37℃继续孵育4 h，弃上清液，每孔加入100 μL DMSO混匀，酶标仪(λ=570 nm)测定光吸收值(OD值)，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=试验组OD值/对照组OD值×100%。

结 果

形态学观察：不同剂量的黄芪多糖作用下，经HE染色，光学显微镜下可见MCF-7细胞缩小，胞膜完整，染色质被浓染，颜色加深，体积变小。试验组与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

Western Blot检测细胞凋亡：1.5 mg/mL和3 mg/mL黄芪多糖作用细胞48 h后，均明显可见凋亡蛋白标志物89 kDa的PARP降解产物表达，对照组和0.75 mg/mL组只观察到116 kDa的蛋白条带。说明黄芪多糖可以诱导MCF-7细胞凋亡，并且凋亡呈剂量依赖性增加，见图1。

Ac-DEVD-CHO对黄芪多糖诱导的细胞凋亡的影响：Caspase-3是凋亡的执行者，加入Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO抑制了细胞中Caspase-3的活性，细胞凋亡则无法执行，因此细胞生存率明显上升。本结果进一步验证了黄芪多糖具有诱导MCF-7细胞凋亡的作用，见表2。

讨 论

乳腺的生长和发育与细胞凋亡密切相关[5]。细胞凋亡是乳腺癌发生、治疗及预后研究中的重要领域[6，7]。

本研究使用Western Blot和光镜方法观察了黄芪多糖对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。结果显示，黄芪多糖可诱导MCF-7细胞凋亡，且诱导MCF-7细胞凋亡能力随药物浓度的增加而增强。但黄芪多糖诱导MCF-7细胞凋亡的分子机制还有待于进行进一步的探讨。

本研究结果显示，黄芪多糖对于抗乳腺癌具有确切效果，为黄芪多糖在抗乳腺癌领域中的应用提供科学依据，为中医药走向国际市场打下坚实基础。

表1 黄芪多糖对MCF-7细胞凋亡的影响(±s)

表1 黄芪多糖对MCF-7细胞凋亡的影响(±s)

剂量(mg/mL) 凋亡细胞率(%)0 6.8±1.79 0.75 7.8±1.92 1.5 13.0±2.55 3 25.4±2.97

表2 加CHO前后黄芪多糖对MCF-7细胞生存率的影响

图1 Western Blot检测细胞凋亡

[1]黄惠风,钱建业.黄芪多糖对人胃癌细胞MKN45诱导凋亡和细胞周期的影响[J].实用临床医药杂志,2010,14(19):17-20.

[2]黄宏思,黄衍强.黄芪多糖协同紫杉醇对肿瘤细胞的杀伤作用[J].右江民族医学院学报,2010,9(1):3-5.

[3]李蓉,谭小武.黄芪多糖诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究进展[J].中国现代中药,2015,17(6):627-629.

[4]谢少茹,沈洪.黄芪多糖对胃癌细胞的生长抑制和促凋亡作用[J].河北中医,2009,31(9):1373-1378.

[5]王迪,张虹.逍遥散诱导乳腺癌细胞凋亡实验研究[J].辽宁中医杂志,2009,36(3):472-473.

[6]谷俊朝,余微波.黄芪多糖对TA2小鼠乳腺癌MA-891移植瘤生长及HSP70表达的影响[J].中华肿瘤防治杂志,2006,13(20):1534-1537.

[7]赵相轩,温锋.细胞凋亡在乳腺癌治疗中的研究进展[J].临床肿瘤学杂志,2017,22(2):175-179.

Experimental study on apoptosis of breast cancer cells induced by Astragalus Polysaccharides

Zhang Hong1,Ji Youbo(Corresponding author)2,Yang Qi3,Sun Xiaoqi1,Leng Xue1
Department of Clinical Medicine,Changchun Medical College 1300311
Department of Orthopedics Medical Center,the Second Hospital Affilitted to Jilin University 1300412
Department of Radiology,the First Hospital Affilitted to Jilin University 1300213

Fund projectScience and technology research project of Jilin provincial education department in"12th Five-Year Plan"《Experimental study of Astragalus Polysaccharides on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7》

Objective:To investigate the apoptosis of breast cancer cells induced by Astragalus polysaccharides.Methods:Morphological observation and flow cytometry were used to detect and observe the human breast cancer cells treated with Astragalus polysaccharides.Results:It showed typical morphological characteristics of apoptotic cells after treated with Astragalus polysaccharides for 48 hours.Western blot results showed that the apoptosis marker protein PARP degradation products increased after the treatment with Astragalus polysaccharides.Conclusion:Astragalus polysaccharides can induce apoptosis of MCF-7 cells.

Astragalus polysaccharides;Mammary cancer;Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.34.1

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究课题《黄芪多糖对人乳腺癌细胞MCF-7抑制增殖和诱导凋亡作用的实验研究》