壳聚糖支架负载SHH和CM—Dil标记的脂肪干细胞移植后存活分化研究

罗鸣骜 伍尚敏 苏晓三 高嘉 于璐 王翼寅 甘凤山

[摘要]目的：观察壳聚糖支架负载音猬因子（Sonic hedgehog，SHH）和脂肪干细胞（adipose-derived stem cells， ADSCs）移植后，ADSCs存活分化的效果。方法：将健康C57BL/6小鼠随机分为A组（PBS+ADSCs）、B组（SHH+ADSCs）、C组（壳聚糖+ADSCs）、D组（壳聚糖+SHH+ADSCs）。将各组混合物分别注射到小鼠背部皮下。术后1、2、4、8周处死小鼠，通过对移植组织一般观察、荧光显微镜观察、HE染色、免疫组化染色来评价移植细胞存活分化的情况。结果：术后8周，壳聚糖支架完全降解，大体观察、HE染色、免疫组化染色均说明壳聚糖支架同时搭载SHH和ADSCs脂肪干细胞存活率较高，新生血管增加，效果均优于A、B、C三组。结论：壳聚糖支架同时负载SHH和ADSCs可有效促进干细胞存活，显著增加血管组织数量。

[关键词]可注射性；壳聚糖；音猬因子；脂肪干细胞；干细胞移植

[中图分类号]R329 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）10-0129-04

Abstract： Objective The aim of our research is to observe the survival and differentiation of adipose Derived stem cells after transplantation with injectable chitosan scaffold loaded with SHH and adipose stem cells. Methods Thirty healthy C57BL/6 mice were selected. Random division group A mixture of PBS and ADSCs，group B mixture of SHH and ADSCs，group C chitosan scaffold loaded with ADSCs，group D chitosan scaffold loaded with SHH and ADSCs.After 1，2，4 and 8 weeks analysis involved general observation，HE staining，immunohistochemical staining of the survival and differentiation of transplanted cells. Results Eight weeks after operation， chitosan scaffold were completely degraded. After 8 weeks，analysis involved general observation，HE staining and immunofluorescence staining showed that Chitosan scaffold loaded with SHH and ADSCs could effectively increase the survival rate of adipose stem cells，increase angiogenesis. All the results were better than that of A、B、C group. Conclusion Chitosan scaffold loaded with SHH and ADSCs can effectively promote the survival of stem cells and spontaneously differentiate into mature adipocytes and increase the number of vascular tissues.May serve as a promising strategy for improving the survival of ADSCs graft survival rate.

Key worlds： syringeability； chitosan； SHH； adipose stem cells； stem cell transplantation

自體游离脂肪是临床上较安全的软组织修复填充材料，但脂肪移植后微血管被破坏，组织处于缺血期，导致细胞死亡[1]，致其存活率降低，临床应用受到极大限制。脂肪干细胞以其来源丰富、易获取、能在体外多代稳定增殖、具有多向分化潜能、免疫相容性好、取材对患者损伤小等优点已成为临床研究热点[2-3]。单纯干细胞移植，因细胞缺乏粘附点呈漂浮状态，即缺乏良好的移植微环境，不利于细胞的存活和正常功能的发挥。壳聚糖因其生物降解性、非抗原性、无毒性，抗菌活性以及良好的生物粘附性和细胞亲和力，被广泛用作细胞载体[4]。本实验将ADSCs同时或分别混合SHH和壳聚糖支架，注射入小鼠的背部皮下，观察细胞移植后存活分化的效果。

1 材料和方法

1.1 实验动物及材料：实验动物：健康雌性C57BL/6小鼠20只，体重18～22g，由昆明医科大学实验动物学部提供。主要试剂：胎牛血清（德国Capricorn Scientific），L-DMEM培养基（美国hyclone），DMSO（美国sigma），PBS（美国gibco），D-PBS（美国gibco），I型胶原酶（北京索莱宝科技有限公司），CM-Dil（美国Invitrogen），SHH（美国R&D;），即用型一抗（丹麦Dako），壳聚糖（美国sigma），tunel试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠ADSCs原代培养及鉴定：C57BL/6小鼠断颈处死后取腹股沟处脂肪组织，参照陈军等[5]的方法进行ADSCs的分离培养，传至第五代，行流式细胞仪检测及成脂成骨分化鉴定。

1.2.2 壳聚糖支架的制备：参考伍尚敏等[6]壳聚糖备制流程加以改进，在磁力搅拌结束后，将溶液加入12孔细胞培养板孔中，1ml/孔。置于-20℃中过夜，取出后冷冻干燥48 h。用75%乙醇浸泡0.5h灭菌，并剪碎为小颗粒，PBS浸洗3次，15min/次，最后在密封条件下紫外灯照射20min。

1.2.3 CM-Dil染色：将消化后的细胞用PBS冲洗两次。标记液50?g CM-Dil加入0.025ml二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），用D-PBS配制为5?g/ml染液，将细胞与染液混合，37℃温箱孵育20min，4℃冰箱孵育15min。标记成功后PBS再次冲洗，用PBS配制成混合悬浊液备用。

1.2.4 实验分组及手术：随机分为4组：即A组：空白对照组（PBS+ADSCs）、B组：干细胞-SHH组（ADSCs+SHH）、C组：壳聚糖-干细胞组（壳聚糖+ADSCs）、D组：实验组（壳聚糖+SHH+ADSCs），每组小鼠各5只。将CM-Dil标记的ADSCs与壳聚糖支架及SHH混合，混合物SHH终浓度300?g/L，用注射器吸取ADSCs-SHH-壳聚糖支架，1%戊巴比妥钠70?l/只，腹腔注射麻醉小鼠，选取背部四点（每点含干细胞数目约为8×105个），将混合物注射入小鼠背部皮下，注射完可见到皮下有轻微隆起，其余各组移植方法相同。

1.3 观察指标

1.3.1 标本处理和组织学观察：OCT组织包埋剂包埋后制作冰冻切片，荧光显微镜观察。其余组织使用多聚甲醛溶液固定脱水后制成蜡块。

1.3.2 HE染色：取上述各组组织石蜡切片，苏木精-伊红常规染色，观察计数完整的细胞数。

1.3.3 免疫组化染色检测CD31、CD34及计数：石蜡切片使用二甲苯脱蜡，乙醇逐级脱水。微波修复抗原，PBS冲洗；3%过氧化氢封闭内源性过氧化氢酶，一抗过夜孵育，PBS冲洗；二抗孵育，PBS，DAB显色，苏木精复染，盐酸酒精分化。脱水、透明、封片、镜检。标本组织HE染色切片，CD31、CD34免疫组化切片均使用Precipoint M8扫描，然后使用网格测试系统，在400倍镜视野下随机选择5个视野计数阳性细胞。

1.4 统计学方法：采用SPSS 19.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x?±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADSCs流式检测成骨成脂诱导分化：镜下观察细胞呈梭形或多边形。流式结果显示CD44、CD90高表达，CD34、CD45低表达（见图1），同时成脂成骨分化鉴定（见图2），证实培养细胞为ADSCs。

2.2 壳聚糖支架的性能：电镜下观察壳聚糖支架呈现疏松多孔结构（见图3a），且壳聚糖支架与ADSCs共同培养结果显示ADSCs可以大量存活并粘附于壳聚糖支架表面（见图3b）。

2.3 荧光显微镜结果：组织冰冻切片观察显示脂肪干细胞大量存活，白光下可见被染色的干细胞（见图4a），在同一视野荧光显微镜下，呈现较强的红色荧光（见图4b）。第四周仍可见荧光存在。

2.4 HE染色：干细胞在壳聚糖支架周围及内部大量存活，较单纯移植组细胞存活更多。第4周脂肪干细胞逐步分化为脂肪细胞，并形成以壳聚糖干细胞混合体为核心的发生中心（见图5）。第8周壳聚糖已被完全降解，在40倍镜下对完整细胞进行计数显示各组存活移植细胞数差异均有统计学意义，除C、D组P<0.05，其余各组均P<0.01。壳聚糖同时负载SHH与ADSCs组与其他组相比存活细胞数显著提高（P<0.05），差异具有统计学意义（见图6）。

2.5 免疫组化结果：各组脂肪组织切片上均可见被标记为棕色的细胞。由于ADSCs的CD31、CD34表达均呈阴性，可以判断标记细胞为新生血管内皮细胞。CD31显示第1周实验组分化出大量新生血管内皮细胞，分布广泛均匀（见图7a），各组新生内皮细胞数量之间比较差异均有统计学意义（P<0.01）。CD34显示第8周实验组已形成大量单层内皮新生血管组织（见图7b），各组血管内皮细胞数量之间比较差异均有统计学意义，除B、C组P<0.05，其余各组P<0.01（见图8）。

3 讨论

自体脂肪组织移植是整形外科手术中增加组织体积和轮廓缺损的一种安全而简便的选择[7]。但自体脂肪移植存在注射后吸收率高，脂肪细胞易死亡，液化坏死的脂肪组织可导炎症及感染等诸多问题[8]。

本实验运用的脂肪干细胞（ADSCs）是从脂肪组织中分离的一种间充质干细胞，具有多向分化潜能[9]，脂肪干细胞相对于成熟脂肪细胞具有强大的增殖分化潜力，对缺氧耐受力更强，且自体干细胞用于移植可避免排异反应，更加安全。脂肪干细胞来源丰富，提取方便，创口小，可与抽脂手术同时进行，且脂肪干细胞能自发地或经诱导分化为脂肪细胞[10]。Zhang等[11]实验证明体内移植的脂肪干细胞完全代谢大约需要28d，本实验在注射ADSCs后检测周期远大于28d，达到8周，这样既可以保证干细胞充分发挥其作用，也可以在一定程度上了解其远期效果。本实验应用CM-Dil荧光染料为移植脂肪干细胞的示踪剂，其是一种亲脂性染料，不溶于水，不从已标记的细胞转移到未标记的细胞，对活体细胞没有任何毒性[12]。

本实验应用的壳聚糖支架原料脱乙酰壳聚糖是一种从甲壳类生物外骨骼中提取的天然线性多糖，具有良好生物官能性和相容性。在体内不积累，無免疫原性，可在体内溶菌酶、甲壳酶的作用下水解成对人体无毒的N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖。壳聚糖支架表面可形成大量微小的孔隙，可显著提高细胞粘附[13]，为细胞生长提供一个三维立体培养的生长环境，而不是单纯注射移植后所呈现的单层或漂浮状态，使组织液更容易渗透到移植部位，维持细胞养分和氧气供给，更利于移植细胞的早期存活和正常功能的发挥。实验中笔者发现干细胞在壳聚糖支架周围及内部大量存活，较单纯移植组细胞存活更多，说明壳聚糖对脂肪干细胞有一定的保护作用。Su X等[10]提出的脂肪起源于筋膜的模型，其在筋膜组织中发现大量脂肪干细胞及脂肪前体细胞。移植后第4周脂肪干细胞逐步分化为脂肪细胞，并形成以壳聚糖干细胞混合体为核心的发生中心，此种现象在壳聚糖-ADSCs组及壳聚糖-SHH-ADSCs均有发生，据此可以认为搭载有脂肪干细胞的壳聚糖支架形成了类似于筋膜组织的脂肪发生中心。

通过特定生长因子可抑制细胞的凋亡及自噬过程，明显减少移植细胞死亡[14]。本实验选用的生长因子—音猬因子属于Hh蛋白家族，对多种器官的形态发生分化起重要作用。SHH信号在血管发生中起关键作用。Hh信号通过血管生长因子调节血管的稳定性，SHH信号蛋白显着增加血管生成相关因子，包括VEGF，FGF和Ang[15]。SHH有助于血管平滑肌细胞的增殖[16]。SHH途径刺激促进血管生成因子的分泌，如激活素A、血管生成素、血管生成素1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、基质金属甲缩肽酶-9和尿激酶型纤溶酶原激活物，可以在体外和体内增强间充质干细胞的促血管生成能力[17]。SHH可直接作用于内皮细胞或刺激血管支持细胞产生无关生长因子，在血管瘤中高表达[18]。SHH作用于皮肤脂肪生成所必需的前脂肪，在缺乏SHH的皮肤中，关键的脂肪形成基因Pparg被下调[19]。免疫组化结果显示第1周实验组分化出大量新生血管内皮细胞，分布广泛均匀，第8周实验组已形成大量单层内皮新生血管组织，各组血管内皮细胞数量之间比较差异均有统计学意义。其促进了脂肪细胞生长，显著提高了移植细胞部位的新生血管数量，提供了充足的血供，为移植细胞长期生存、功能的发挥提供了保障。

本实验结果表明ADSCs-SHH-壳聚糖支架移植在增加细胞存活率，促进血管新生均具有显著作用。其原因可能为：壳聚糖支架提供了良好的细胞生长微环境，促进了ADSCs存活分化和正常功能的发挥。SHH能促进血管新生，从而减缓凋亡、坏死及退行性变性，促进干细胞增殖，壳聚糖支架与SHH可以分别在移植早期和晚期保证移植细胞的供血供氧，其联合作用为细胞的存活及功能发挥提供了有利条件。

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[收稿日期]2018-08-24 [修回日期]2018-09-20

编辑/贾敏