基于复杂网络的穴位-分子生物学效应研究＊

黄满婷，雷 蕾，李海燕，杨 策，聂 莹，亢 力

（中国中医科学院中医药信息研究所 北京 100700）

复杂网络作为一种新兴的科学研究方法和工具，为复杂系统的研究打开了新的视角，其研究涉及到系统科学、数学、统计物理学、计算机科学等多个学科[1]。近年来，中医药领域复杂性研究对复杂网络的应用逐渐增多，大量研究表明，采用复杂网络方法和工具可以更加深入且直观地体现出中医药复杂体系中的科学性[2]。针刺穴位的作用机制一直以来是研究者们关注的热点问题，亦因此产生了大量的研究成果，前期本研究团队以疾病脑缺血为出发点，以文献研究成果为数据来源，运用复杂网络的方法探讨了针刺治疗脑缺血的选穴规律及其分子作用机制[3]，为本次研究奠定了一定的基础。本研究旨在探寻更多的穴位-分子效应关系，以期为相关领域研究者及临床应用提供一些参考。

1 资料与方法

1.1 数据来源

采用检索策略：针刺OR针灸OR电针（特征词：动物），文献年限为1956-2015年12月，从《中国知网》（CNKI）、《万方数据资源库》和《中国生物医学文献数据库》（CBM）三大数据库中检索针刺实验文献题录，以“基因表达”和“蛋白表达”为关键词和主题词对文献题录进行筛选，去重后获得研究所需文献。

1.2 文献纳入标准和排除标准

纳入标准：针刺疗法的动物实验研究文献

排除标准：①文献综述；②人或动物的临床实验文献；③以针刺作为对照组的文献；④药物注射对针刺效应影响的相关文献；⑤火针、刺血疗法、电刺激疗法及砭法相关文献；⑥单纯穴位疗法及单纯艾灸疗法相关文献；⑦按摩推拿疗法、运动针疗法及心理疗法相关文献；⑧针药结合相关文献。

1.3 数据规范

根据原文采集针刺部位信息和其相对应的有效调节的分子水平效应信息，针刺部位数据参照中医药主题词表（TCMeSH 2015）版＊＊ 中国中医科学院中医药信息研究所.中国中医药主题词表:[DB/OL].(2015-11-27)[2017-04-25].http://tcmks.cintcm.com:8080/cmtpub/mvccon⁃troller?pEvent＝USER_LOGIN.html＊＊ The National Center for Biotechnology Information.Genes&Expression：[DB/OL].[2017-04-25].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.html.进行规范，分子效应指标数据参照NCBI-Gene and Protein＊＊＊ 中国中医科学院中医药信息研究所.中国中医药主题词表:[DB/OL].(2015-11-27)[2017-04-25].http://tcmks.cintcm.com:8080/cmtpub/mvccon⁃troller?pEvent＝USER_LOGIN.html＊＊ The National Center for Biotechnology Information.Genes&Expression：[DB/OL].[2017-04-25].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.html.进行规范。

1.4 统计学分析

对规范好的数据进行审核去重后，运用Excel 2010、Access 2010软件进行频次统计计算，运用Py⁃thon编程语言编写的软件进行计算，构建穴位-分子效应关系网络，通过复杂网络软件Cytoscape3.3.0对网络进行分析，并结合MCODE聚类插件对针刺部位-分子效应网络进行化模块聚类分析和可视化展示。

2 结果

2.1 分子和针刺部位的频次统计

选取经过规范后的穴位数据和分子数据，对文献ID进行去重合并，以确保每一篇文献ID对应一个词条。将穴位数据与分子数据通过唯一的文献ID号进行匹配，去除同一文献ID号下只有穴位或只有分子的条目，获得最终有效数据。对所获得的数据分别进行拆分并统计频次，分别获得与分子相匹配的针刺部位233个，分子793个，由高到低排序，分别选取两项内容的前十项见表1。从表中可以看出针刺部位前十项累计频次56.12%，其中频次最高的是穴位足三里（722）；分子指标前十项累计频次达22.87%，不足总指标数的1/3，且频次大于100的只有两项，分别为BCL2（抗凋亡基因）和FOS（原癌基因），说明分子指标较分散，反映出针刺实验研究在分子水平的指标选择是多样的，并没有很集中地研究某一指标的针刺效应。

2.2 针刺部位-分子关系网络构建与分析

将穴位数据和分子数据以唯一的文献ID号进行匹配关联，分子和针刺部位作为网络的结点，针刺部位和针刺部位、针刺部位和分子、分子和分子同时出现在同一篇文献并且有确定效应关系时则形成一条边，运用Python编程语言编写的软件进行计算，构建穴位-分子效应关系网络，定义网络中的三种关系分别为针刺穴位的配伍关系、分子之间的相关关系及针刺部位的分子效应关系，获得一个含有1026个结点和8811条边的网络，此网络结点度和边权值较高的数据情况见表2和表3。

表1 针刺部位和分子频次统计（前10项）

表2 针刺部位-分子网络结点度排名前15项

表3 针刺部位-分子网络三类边权值排名前5项

表4 针刺部位-分子网络中点度中心度、中间中心度、接近中心度都较大的结点

图1 模块1

在网络中，结点度越高，则表示与这个结点相连的结点越多，说明此结点在网络中处于中心位置。从表2可以看出，在针刺部位-分子网络中，结点度最高的针刺部位是足三里穴，与其相邻的结点有480个；结点度最高的分子是BCL2，与其相邻的结点有98个，说明在此网络中处于中心位置的穴位为足三里，处于中心位置的分子指标是BCL2。根据文献报道[4-8]，BCL2是与细胞凋亡过程关系最密切的基因，属于抗凋亡基因，通过调控其表达量，可以有效控制细胞的凋亡，针刺穴位可有效促进缺血状态下BCL2的表达。

在网络中，边权值表示这条边连接的两个结点一同出现的频率，边权值越大，则两结点同时出现的频率越大。从表3三类边权值排序可以发现以下几点：第一，穴位共现频次最高的是大椎和百会，并发现共现频次较高的穴位亦是结点度较高的穴位，说明结点度较高的穴位常常相互配伍使用；第二，共现频次最高的分子是BCL2和Bax，这两个分子同属凋亡基因家族，前者是抑凋亡基因，后者属促凋亡基因，在研究过程中常常被同时观测并计算两者比值[9-12]；第三，分子和分子同时出现的频率整体上低于穴位和穴位同时出现的频率，因此可以推测针刺实验在研究分子机制时对单个分子的研究较为普遍，而成族的研究较少；第四，从穴位和分子边权值排序可以看出和BCL2最常同时出现的是百会穴，其次是足三里穴，表明在针刺实验研究过程中常常选用百会穴和足三里穴来研究BCL2的变化。

为进一步研究此关系网络的特征，将针刺部位-分子数据导入Cytoscape3.3.0软件进行计算，得出该网络的密度为0.017，网络直径为6，网络集中化为0.452，网络异质性为1.765，聚类系数为0.779，说明此网络结点之间联系相对紧密；最短路径为1051650，平均路径长度为2.554，说明该网络符合复杂网络的小世界性；孤立点数为0，说明此网络为闭合型复杂网络。

为了分析此网络中每个结点的相互关系，本研究通过分析结点的点度中心度、接近中心度、中间中心度进行对结点个体的研究，由此了解结点个体在网络中发挥的作用，即每个穴位或分子在网络中与其他穴位或分子的关系。由于此网络结点数较多，故这里只展示三中心度都较大的结点作为示例进行讨论，见表4。

从表4中可以看出，三中心度都较大的结点均为穴位，说明在针刺实验研究过程中不同的研究者在穴位的选取上是比较集中的；同时还反映出在网络中表4中七个穴处于网络的中心地位，并有很强的纽带作用，表现为与其可配伍的穴位较多或其可调节的分子指标较多，并且在配伍性和调节程度上均强于其他穴位。为了更进一步地了解穴位配伍关系和其可调节的分子内容，本研究引入了复杂网络的化模块聚类分析算法来对此网络进行模块划分。

2.3 针刺部位-分子网络化模块聚类结果分析

运用复杂网络软件Cytoscape3.3中的MCODE聚类插件计算针刺部位-分子效应网络核心互作网络模块（Score＞2）。结果共获得核心互作用模块50个，其中Score＞10的有4个，见图1-4。在模块中，结点为穴位和分子，边为结点之间的互作关系，其中穴位与穴位是配伍关系，分子与分子是相关关系，穴位与分子是调节关系。

图2 模块2

图3 模块3

图4 模块4

图5 模块2落入代谢通路（has01100：has01100:Metabolic pathways）的分子穴位关系网络图

从图中可以看出，模块1包含40个分子和4个穴位，涉及946个互作关系（MCODE Score=44）；模块2包含56个分子和5个穴位，涉及915个互作关系（MCODE Score=30.5）；模块3包含56个分子和12个穴位，涉及638个互作关系（MCODE Score=19.045）；模块4包含26个分子和9个穴位，涉及206个互作关系（MCODE Score=12.118）。由此说明，模块中的分子和穴位在整个网络中互作用关系紧密，那么可以推测处于同一模块中的分子大都有相同的功能，或者都与同一疾病有关，又或者属于同一个生物通路。为了验证推测，本研究借助DAVID数据库*＊ National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID),NIH.DAVID Bioinformatics Resources 6.8:[DB/OL].[2017-04-25].https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp.html对这4个模块中涉及到的分子进行分子功能注释，从而了解其成族关系的具体内容。

将这四个模块中涉及到的分子分别丢入DAVID数据库中进行分子功能注释，寻找与人类生理病理过程相关的基因及其代谢通路，并对结果结合临床实际进行分析。结果显示：模块1有34个基因被找到，其中有21个基因分布在133个代谢通路中，聚集基因数较多的通路有4个；模块2有44个基因被找到，其中有36个基因分布在163个代谢通路中，聚集基因数较多的通路有3个；模块3有42个基因被找到，其中有38个基因分布在167个代谢通路中，聚集基因数较多的通路有2个；模块4有21个基因被找到，其中有17个基因分布在106个代谢通路中，聚集基因数较多的通路有1个。部分结果详见表5。

表5 针刺部位-分子网络模块分子功能注释结果表

从表5中可以看出，相对于其他3个模块，模块2的分子之间功能更为集中，有1/3（12/36）的分子被聚集在代谢通路中（hsa01100:Metabolic pathways），其网络关系图见图3。

图中12个基因分别为线粒体ATP合酶（ATP5H）、腺苷酸激酶（adenylate kinase 1 AK1）、血小板激活因子乙酰水解酶1b催化亚基2（platelet activating factor acetylhydrolase 1b catalytic subunit 2 PAFAH1B2）、磷酸甘油酸酯变位酶1（phosphoglycerate mutase 1 PGAM1）、泛醌细胞色素 c还原酶（ubiquinol-cyto⁃chrome c reductase UQCRFS1）、磷酯酶Cβ1抗体（phos⁃pholipase C beta 1 PLCB1）、细胞色素c氧化酶亚基5 b（cytochrome c oxidase subunit 5B COX5B）、肌酸激酶B（creatine kinase B CKB）、过氧化物氧化还原酶6（per⁃oxiredoxin 6 PRDX6）、NME/NM23核苷二磷酸激酶1（NME/NM23 nucleoside diphosphate kinase 1 NME1）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH）、岩藻糖基转移酶 4（fucosyl⁃transferase 4 FUT4），可以推测针刺穴位足三里、内关、水沟、粱门、四白可能会对代谢通路有所调节。同时，穴位足三里、粱门、四白属于足阳明胃经腧穴，均可治疗胃经疾病；内关为手厥阴心包经穴，是八脉交会穴之一，与阴维脉相通，阴维脉与足太阴脾经相通，故内关亦可治疗脾胃肠疾病；水沟是急救要穴。那么可见这五个穴位均可用于治疗脾胃肠系疾病及相关症状，可以推测针刺这些穴位治疗疾病的生物学机制有可能是通过刺激这12个基因调节代谢通路，从而达到治疗目的；亦可推测足阳明胃经和代谢通路关系密切，有待进行进一步的的研究来证实。

3 结论

本文运用复杂网络的方法对针刺部位-分子网络进行了计算分析，并引入MCODE算法，对网络进行了模块划分，得到了穴位与分子之间更深层次的互作用关系，发现足三里穴是针刺实验研究的最常用穴位，足阳明胃经可能与代谢通路关系密切，尤其是与一些相关生物因子相联系，体现了中医理论的现代化，为临床及实验研究提供新的研究思路。此外，本研究还发现针刺实验研究对于分子水平的研究较为松散，相互之间联系不紧密，此现象出现的原因可能是实验研究对分子水平的研究较少且不成系列研究，针对这一可能的原因，在此后的研究过程中可以进一步在针刺对分子水平的调节发面深入并成系统研究。

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