灵芝提取物对提高小鼠机体免疫力作用研究

程丽佳，谢欣蓉，杨 明，刘 凤，练心洁，蒋福荣

(1.成都大学 医学院(护理学院)，四川 成都 610106；2.成都大学 药学与生物工程学院，四川 成都 610106)

灵芝提取物对提高小鼠机体免疫力作用研究

程丽佳1，谢欣蓉1，杨 明1，刘 凤2，练心洁2，蒋福荣1

(1.成都大学 医学院(护理学院)，四川 成都 610106；2.成都大学 药学与生物工程学院，四川 成都 610106)

为研究灵芝提取物多糖和生物碱对小鼠机体免疫功能的影响，将36只雌性BALB/c小鼠随机分为3组(n=12)，A组为多糖组，B组为组生物碱组，C组为空白对照组分别连续灌胃15 d(中期)和30 d(终期).灌胃结束后进行小鼠巨噬细胞吞噬能力、T淋巴细胞转化能力和外周血interferon-γ(IFN-γ)水平的测定.实验显示，灵芝提取物多糖和生物碱均能明显增强小鼠巨噬细胞吞噬能力和T淋巴细胞转化能力，同时可提高小鼠外周血中IFN-γ的表达水平.结果表明，灵芝多糖和生物碱能有效提高小鼠免疫功能.

灵芝提取物；免疫力；多糖；生物碱

0 引 言

灵芝是我国名贵的中药材，具有增强免疫力、保护肝脏、抑制肿瘤细胞生长等功效[1-2].研究发现，灵芝多糖、灵芝三萜、灵芝生物碱等是灵芝的主要活性成分[3].目前，关于灵芝粉，灵芝孢子油等对机体的免疫调节的研究较多[4-5]，但对于其具体的免疫调节有效成分的研究却少有报道.对此，本研究通过提取灵芝有效成分——灵芝多糖和灵芝生物碱，分析其对提高机体免疫力的作用，拟为灵芝提取物的临床治疗和食用保健开发提供相关实验数据.

1 材料与方法

1.1 材 料

实验所用材料包括：36只清洁级雌性Balb/c小鼠(18～22 g)，购自成都达硕实验动物公司，灵芝，购自四川新荷花中药饮片股份有限公司；植物血凝素(PHA、MTT)，购自美国Sigma公司，IFN-γELISA试剂盒，购自上海纪宁实业有限公司.

1.2 灵芝多糖与灵芝生物碱的提取

灵芝打粉后用70 %乙醇浸泡过夜，取灵芝菌粉适量，放入圆底烧瓶，加入适量蒸馏水，按一定条件(料液比、温度、时间、粒度)进行超声波提取2次，过滤，滤液合并，乙醇沉淀，制得灵芝粗多糖样品[6].灵芝生物碱样品则是通过盐酸浸泡后，收集析出液，沉淀后得到.

1.3 小鼠灌胃脏器/体质量比值测定

实验前，对每只小鼠称重做好记录，然后将36只小鼠随机分为3组，A组为灵芝多糖组，B组为灵芝生物碱组，C组为空白对照组.分别用灵芝多糖、灵芝生物碱及生理盐水连续灌胃15 d和30 d.灌胃结束后，取小鼠胸腺及脾脏进行称重并做好记录.

1.4 T淋巴细胞转化实验

研究证实，ConA能诱导T细胞增殖[7-8].实验中，取小鼠脾脏，用刮梳法取淋巴细胞，将细胞悬液吸入离心管中，离心沉淀细胞，制作细胞悬液，浓度调至1×106/mL.然后，将细胞悬液加入到96孔培养板中，在培养结束前4～6 h，于培养板各孔内加入MTT液，37 ℃培养4～6 h后，1 000 r/min离心10 min，弃上清，各孔内加入盐酸—异丙醇，溶解，30 min内用酶标仪测光密度值(OD).

1.5 巨噬细胞吞噬实验

实验前1天，向小鼠腹腔注射1 mL台盼蓝染液.实验前30 min，向小鼠腹腔内注射1 mL 0.5%的鸡红细胞，轻揉腹部使其分散.30 min后，用颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，用1 mL注射器吸取腹腔液，每次滴一滴腹腔液制作血涂片，并进行瑞氏—吉姆萨染色，最后在显微镜下进行观察并拍照.

1.6 ELISA测定小鼠血液IFN-γ水平

取小鼠眼球静脉血，3 000 r/min离心10 min收集血清.使用ELISA试剂盒，按说明书测定血清中的IFN-γ水平，结束后15 min内用酶标仪(波长450 nm处)测定光密度值(OD).

1.7 统计学分析方法

采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行处理，数据采用均数±标准差(±s)表示，比较采用t检验；P<0.05代表差异具有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 灵芝提取物对小鼠脏器/体质量的影响

小鼠经灵芝多糖与灵芝生物碱灌胃后，其胸腺、脾脏所占体质量比值变化情况如图1所示.

A.空白对照组;B.生物碱组;C.多糖组

图1小鼠经灵芝多糖、生物碱灌胃后，小鼠的胸腺、脾脏所占体质量比值变化情况(*P<0.05)

由图1可知，灵芝多糖组在中期(15 d)、终期(30 d)对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响与空白对照组比较，差异有显著性(P<0.05)，而灵芝生物碱组仅在终期对小鼠胸腺指数和脾脏指数有显著性影响(P<0.05).

2.2 灵芝提取物对小鼠细胞免疫功能的影响

小鼠经灵芝多糖与灵芝生物碱灌胃后，其细胞变化情况如图2所示，对小鼠T淋巴细胞转化能力的影响见表1.

A：小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞瑞氏—吉姆萨染色图；B：小鼠巨噬细胞吞噬率；C：小鼠巨噬细胞吞噬指数

图2小鼠经灵芝多糖、生物碱灌胃后与对照组在15 d和30 d的细胞变化情况(*P<0.05)

组 别剂量/(mg/kg)T淋巴细胞转化率/%中期(15d)终期(30d)灵芝多糖组140.208100.01±8.52*133.36±9.45*生物碱组140.4880.32±5.2387.33±6.23*空白对照组140.5675.35±7.3676.23±6.39

注：与空白对照组相比，*P<0.05.

由图2、表1可知，灵芝多糖对中期(15 d)、终期(30 d)灌胃小鼠T淋巴细胞转化率与对照组比较，均有提高，差异性显著(P<0.05)；而灵芝生物碱仅在30 d时可显著提高小鼠T淋巴细胞转化率(P<0.05)，15 d时差异不显著(P>0.05)；灵芝多糖组对中期(15 d)、终期(30 d)灌胃小鼠吞噬率与吞噬指数与空白对照组比较，差异性显著(P<0.05)；而灵芝生物碱组巨噬细胞吞噬率与吞噬指数与空白对照组比较，仅终期有差异性显著(P<0.05).实验证明，灵芝多糖对提高小鼠免疫力作用较为显著.

2.3 血液IFN-γ水平的表达

经灵芝多糖与灵芝生物碱作用后小鼠血液中IFN-γ水平表达与对照组相比在15 d与30 d的变化如图3所示.

图3小鼠血液中IFN-γ水平的表达(*P<0.05)

由图3可知，灵芝多糖组和灵芝生物碱组对中期(15 d)、终期(30 d)灌胃小鼠血液中IFN-γ水平表达与空白对照组比较，差异性显著(P<0.05).实验结果表明，灵芝多糖和灵芝生物碱都能提高小鼠血液中IFN-γ水平的表达，但多糖效果优于生物碱.

3 讨 论

本研究分别给予小鼠每天140 mg/kg灵芝多糖和灵芝生物碱灌胃，分别持续灌胃15 d和30 d后，未见其对小鼠体质量有不良影响.在小鼠脏器/体质量比值、淋巴细胞转化率、巨噬细胞吞噬率和吞噬指数的测定中，灵芝多糖组与灵芝生物碱组分别与对照组相比，灵芝多糖组在中期与终期，其比值有显著性差异(P<0.05)，灵芝生物碱组在中期无显著性差异(P>0.05)，在终期有显著性差异(P<0.05).而在小鼠血液IFN-γ水平测定中，灵芝多糖组与灵芝生物碱组分别与对照组相比，2组IFN-γ水平均有显著性差异(P<0.05).

脾脏是动物重要的免疫器官，脾脏质量的增加相对表明机体免疫功能增强[9].在本实验中，灵芝多糖组在中期、终期对小鼠脏器/体质量、吞噬能力和T淋巴细胞转化能力均有提高.而对应能力在灵芝生物碱组的中期无有效提高，在终期提高较为明显.灵芝多糖组与灵芝生物碱组的灌胃小鼠外周血血清中IFN-γ含量与对照组比较均有提高，说明灵芝多糖与灵芝生物碱均能增加IFN-γ分泌量，并以此调节小鼠机体免疫功能.

小鼠免疫功能实验的结果表明，灵芝提取物在等剂量时均对提高小鼠机体免疫力有一定作用，但灵芝提取物多糖对提高小鼠机体免疫力作用更为显著和快速，而灵芝生物碱发挥作用时间较慢.

4 结 论

本研究发现，灵芝提取物多糖与生物碱对小鼠免疫功能有促进作用.此表明，在临床上对于免疫力较低人群可辅以灵芝多糖与灵芝生物碱所制药物加以治疗可以增强其机体的免疫调节功能，对免疫功能一般的人群辅以灵芝提取物所制保健品可提高其机体的免疫力.

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[2]刘佳,王勇.灵芝多糖的研究进展[J].现代药物与临床,2012，33(6):629-634.

[3]Bhardwaj N,Katyal P,Sharma A K.SuppressionofinflammatoryandallergicresponsesbypharmacologicallypotentfungusGanodermalucidum[J].Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov，2014，8(2):104-117.

[4]高歌.纳米级灵芝粉末和破壁灵芝孢子粉的化学成分及体外药理活性研究[D].长春：吉林农业大学，2012.

[5]金玲,刘菊妍,孙升云,等.灵芝孢子油软胶囊对H22肝癌小鼠抑瘤作用及免疫功能的影响[J].中华中医药杂志，2011，26(4):715-718.

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[9]王君巧,聂少平,余强,等.黑灵芝多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节和抗氧化作用[J].食品科学,2012,33(23):274-277.

StudyonEffectsofGanodermaLucidumExtractonImmunityofMiceOrganism

CHENGLijia1,XIEXinrong1,YANGMing1,LIUFeng2,LIANXinjie2,JIANGFurong1

(1.School of Medicine(School of Nursing), Chengdu University, Chengdu 610106, China；2.School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

The paper is going to study the effects of Ganoderma lucidum extract that are polysaccharide and alkaloid on the immune function of mice organism.The 36 female BALB/c mice are randomly divided into 3 groups(n=12):polysaccharide group(group A),alkaloid group(group B) and the control group(group C).All mice are under intragastric administration for 15 days(Medium-term) and 30 days(Final-term).At last,their macrophage phagocytosis ability,T lymphocyte transformation capacity and interferon-gamma (IFN-γ) levels are measured.The results show that both the polysaccharides and alkaloids can significantly enhance the phagocytosis of macrophage ability,T lymphocyte transformation capability and the expression of IFN-γ in peripheral blood.It's concluded that both the polysaccharide and alkaloid of Ganoderma lucidum can improve the immune function of mice.It's suggested that the immunocompromised people take the ganoderma lucidum products to improve their immunity.

Ganoderma lucidum extract;immunity;polysaccharide;alkaloid

R285.5

A

1004-5422(2017)04-0361-04

2017-09-30.

国家自然科学基金(51402027)、 药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室(10Y201704)资助项目.

程丽佳(1989 — )，女，博士，副教授，从事生物材料骨诱导机制研究.