温州地区地中海贫血基因突变类型分析

徐琦煜，周武，钱菁菁，周翠

（温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015）

·短 篇 论 著·

温州地区地中海贫血基因突变类型分析

徐琦煜，周武，钱菁菁，周翠

（温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015）

目的：了解温州地区地中海贫血（简称地贫）基因突变类型和构成比，为优生优育提供参考。方法：选取温州医科大学附属第一医院和温州医科大学附属第二医院门诊及住院的疑似地贫患者991例，进行地贫基因突变检测，其中3种缺失型α-地贫采用跨越断裂点PCR（GAP-PCR）法；3种α-地贫点突变和17种常见β-地贫突变采用反向点杂交（RDB）法。结果：991例疑似地贫患者中共检出431例地贫患者，阳性率为43.49%。其中α-地贫155例，最常见的为--SEA/αα缺失（占α-地贫的67.10%）；检出β-地贫276例，最常见为CD41-42突变（占β-地贫的35.87%）；同时检出αβ复合型地贫基因7例。结论：温州地区的地贫基因突变类型多且复杂，应加强基因诊断，为地贫的遗传咨询和临床诊疗提供参考。

α地中海贫血；β地中海贫血；突变类型；点突变

地中海贫血（thalassemia）简称地贫，是由于血红蛋白珠蛋白肽链合成障碍或速率降低、血红蛋白产量减少所引起的一组遗传性溶血性贫血。其中较为常见的有α-地贫和β-地贫，α-珠蛋白基因位于16号染色体短臂13区3带，其缺失或点突变均可导致α-地贫，其中缺失型最多见；β-珠蛋白基因位于11号染色体短臂1区2带，多由点突变引起β-地贫[1]。地贫是世界上最常见和发病率最高的，也是危害最严重的血红蛋白病之一，我国广西、广东等地多见[2]。温州位于浙江省东南部，随着外来人口的增加，尤其是来自地贫高发率地区，将不可避免地提高本地区地贫的发生率。本研究对温州地区991例疑似地贫患者的基因突变类型进行研究，探讨该地区地贫基因突变的类型及构成比，为温州地区开展地贫的遗传咨询和产前诊断提供重要的参考依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2015年12月温州医科大学附属第一医院和温州医科大学附属第二医院门诊及住院疑似地贫患者991例，年龄为2 d至75岁，其中男432例，女559例。入选标准：血常规平均红细胞体积≤80 fL，平均红细胞血红蛋白＜27 pg，血样间无亲缘关系，性别和年龄均不限。基因型检测试剂盒购于深圳亚能生物有限公司。本研究经本院伦理委员会批准，所有检测均获得患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 全血DNA的提取：用无菌EDTA抗凝管抽取静脉血2 mL，采用DNA快速提取试剂盒提取DNA，操作步骤见试剂盒说明书。

1.2.2 缺失型α-地贫基因检测：采用跨越断裂点PCR法（GAP-PCR）检测3种常见基因缺失（--SEA/αα、-α4.2/αα、-α3.7/αα）。PCR反应体系：总体积25 μL，含PCR反应液21 μL、DNA模板2 μL、纯水2 μL。反应条件：96 ℃预变性5 min，然后98 ℃变性45 s，65 ℃退火90 s，72 ℃延伸3 min，共25个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带大小判断基因型结果。

1.2.3 非缺失型α-地贫和β-地贫基因检测：采用反向点杂交法（reverse dot blot，RDB）检测3种α-地贫基因点突变（αCSα、αQSα、αWSα）和17种β-地贫基因突变位点（CD41-42、IVS-I I-654、CD17、CD27/28、-28、-29、Int、CAP、IVS-I-1、CD43、βE、CD31、CD14-15、CD71-72、-30、-32及IVSI-5）。PCR反应体系：总体积25 μL，含PCR反应液23 μL，DNA模板2 μL。反应条件：50 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共25个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物通过杂交膜条斑点显色特点确定基因型，正常斑点全部显色且无异常突变斑点同时显色为正常基因型，突变斑点及其相应正常斑点同时显色为突变杂合子，突变斑点显色而相应斑点不显色则为突变纯合子。

2 结果

共收集温州地区疑似地贫患者991例，其中431例检测出地贫基因，总阳性率为43.49%。155例检测出带有α-地贫基因，阳性检出率为15.64%（占总阳性率的35.96%）；其中杂合子125例（占80.66%）、纯合子2例（占1.29%）、双重杂合子28例（占18.06%），见表1。α-地贫基因检测部分结果见图1-2。276例带有β-地贫基因，共11种基因类型，阳性检出率为27.85%（占总阳性率的64.04%）；其中杂合子259例（占93.84%）、纯合子5例（占1.81%）、双重杂合子12例（占4.35%），见表2。β-地贫基因检测结果见图3。7例αβ复合型地贫，阳性率为0.71%（占总阳性率的1.62%），见表3。

表1 α-地贫基因检测结果[ n=155，n（%）]

图1 GAP-PCR法检测缺失型α-地贫基因结果

3 讨论

图2 RDB法检测非缺失型α-地贫基因结果

本研究中991例标本共检测出431例携带地贫基因，阳性率为43.49%，其中α-地贫155例，包括--SEA、-α4.2、-α3.7、αCSα、αQSα 5种类型，阳性率为15.64%，β-地贫276例，包括CD41-42、IVSII- 654、CD17、CD27/28、-28、-29、Int、CAP、IVSI-1、CD43及βE共11种类型，阳性率为27.85%。最常见的α基因缺失类型为--SEA/αα，占所有α-地贫的67.10%。在检测到的11种中国人常见的β-地贫基因突变类型中，以CD41-42所占比例最高，占所有β-地贫的35.87%，其次为IVS-I I-654、CD17以及CD27/28，分别占32.25%、16.67%、7.25%，其余类型相对较低，与何建维等[3]报道相似。本研究的样本选自温州医科大学附属第一医院和温州医科大学附属第二医院，这两个医院是温州地区的三甲医院，能反映温州地区的地贫基因情况，温州地区的β-地贫检出率大于α-地贫，以β-地贫为主，与北京、重庆等地相同[4]，而与高发的广东、广西地区的情况则相反[5]，说明地贫具有高度遗传异质性，不同地域其基因突变不同，有着显著的地域差异，不同地区人群中的发病率及遗传背景有很大差异。同时本研究中温州地区存在5例β-地贫纯合子以及12例β-地贫双重杂合子，β-地贫基因突变较复杂，加大了准确诊断的难度。

α-地贫和β-地贫均可分为静止型、轻型、中间型及重型4种，危害最大的是重型α-地贫和重型β-地贫。中间型α-地贫又称HbH病，是α-地贫-1和α-地贫-2的双重杂合子，是由于4个α基因中有3个有缺陷，此型临床表现差异较大，出现贫血的时间和贫血轻重不一，避免这类患儿出生是地贫防治工作的重点和主要目标。本研究中，共检到28例HbH病患者，占地贫总检出率的6.5%，以--SEA/-α3.7最为常见，占地贫总检出率的4.41%。另外还有--SEA/-α4.2和--SEA/αCSα，分别占1.16%和0.93%。

表2 β-地贫基因检测结果[ n=276，n（%）]

图3 RDB法检测β-地贫基因部分结果

表3 αβ复合型地贫基因检测结果（n=7，n）

另外，本研究还检测出7例αβ复合型地贫，阳性率为0.71%，主要为CD41-42的β基因突变复合α基因型，稍低于一些地区的检出率。αβ双重杂合子由于α-链和β-链的相对不平衡比单纯的α-地贫或β-地贫杂合子有所减轻，其贫血症状反而会因此有所减轻。但是因这种双重杂合子个体无论是与α-地贫还是β-地贫杂合子个体婚配，均有机会生育重型地贫患儿。因此，准确判断β-地贫复合α-地贫双重杂合子对于遗传咨询和准确进行产前诊断具有重要意义[6]。

目前对于重型地贫患儿尚无有效的治疗方法，只能对症输血或进行干细胞移植[7]，但是干细胞移植配型困难而且费用高，所以防止重型地贫患儿的出生显得尤为重要。近年来可能由于生活水平的改善，重型地贫患者比原来存活时间更长，而轻型地贫患者（携带者）因为没有明显的临床症状常常被漏诊。若夫妇双方均为同一类型轻型地贫基因携带者，每次怀孕，其子女有25%的机会为正常，50%的机会成为地贫基因携带者，另外还有25%的机会患上重型地贫；虽然地贫在我国南方分布广泛，各省尚未将地贫筛查纳入婚前和孕妇常规检查项目，尤其近年取消了强制性婚检制度等，这些综合因素导致了群体中地贫的基因突变频率和患病率增加。目前PCR方法结合RDB技术成熟，是临床上检测地贫的主要基因检测方法，但目前我国疾病流行病学调查的严重缺乏与疾病实验研究的突出成绩已形成巨大反差[8]。因此应根据温州地区流行病学资料进行地贫突变类型的研究，在婚前、孕前及孕期积极广泛筛查地贫，进行地贫基因的产前诊断及基因分析，为进一步进行基因诊断和遗传咨询提供参考，以防止重型地贫患儿的出生，以指导优生优育，对提高人口素质具有重要意义。

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[1] 郭华, 蓝慧娟. 珠蛋白生成障碍性贫血基因检测技术的研究进展[J]. 国际检验医学杂志, 2011, 32(10)： 1090-1092.

[2] HIGGS D R, ENGEL J D, STAMATOYANNOPOULOS G.Thalassaemia[J]. Lancet, 2012, 379(9813)： 373-383.

[3] 何建维, 黄恒柳, 张燕, 等. 重庆地区地中海贫血基因突变类型分析[J]. 国际检验医学杂志, 2014, (18)： 2488-2489.

[4] 甘勇, 杨卓, 陈倩, 等. 北京地区α和β地中海贫血患者基因突变谱分析[J]. 中国卫生检验杂志, 2014, 24(12)： 1750-1753.

[5] 陈熙, 肖克林, 罗茗月, 等. 地中海贫血实验室筛查指标评价[J]. 分子诊断与治疗杂志, 2016, 8(4)： 242-245, 288.

[6] 蔡永林, 郑裕明, 汤敏中, 等. β-地中海贫血复合缺失型α-地中海贫血双重杂合子的分子检测及血液学分析[J]. 中国实验血液学杂志, 2007, 15(1)： 195-197.

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[8] 王燕燕, 李晓辉, 徐西华. 地中海贫血诊治进展与我国现状[J]. 中国实用儿科杂志, 2013, 28(6)： 473-476.

Analysis of thalassemia gene mutation types in Wenzhou

XU Qiyu, ZHOU Wu, QIAN Jingjing, ZHOU Cui.
Department of Clinical Laboratory, the First Aff i liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou,325015

Objective： To investigate the gene mutation type and constituent ratio of thalassemia, so as to provide prenatal and postnatal care. Methods： Nine hundred and ninety one suspected thalassemia patients from the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University and the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University were included. GAP-PCR method and reverse dot blot (RDB) method were adopted to detect 3 common gene deletions in α-gene mutation and 3 point mutation in α-gene mutation, 17 common mutation sites in β-gene mutation. Results： From 991 suspected thalassemia patients, 431 thalassemia cases were detected(43.49%), including 155 α-thalassemia mutations and 276 β-thalassemia mutations. Southeast Asia deletion--SEA/αα (accounted for 67.10%) was the major types of α-thalassemia mutations. For β-thalassemia patients, the hot spots of mutation was CD41-42 (accounted for 35.87%). α-thalassemia combined with β-thalassemia were detected in 7 patients. Conclusion： α and β-thalassemia in populations of Wenzhou are complex. In order to provide valuable information with genetic counseling and clinical therapy, it is important to strengthen genetic diagnosis.

α-thalassemia; β-thalassemia; mutation types; point mutation

R446.1

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.11.014

2016-09-19

徐琦煜（1984-），女，浙江乐清人，主管技师。

贾建敏）