胃袖状切除术改善2型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗机制研究*

赵文嫣，孙明，冯勇，耿东华，刘金钢

（1.中国医科大学附属盛京医院1.普通外科，2.泌尿外科，辽宁 沈阳 110004；3.中国医科大学附属第四医院 普通外科，辽宁 沈阳 110032）

胃袖状切除术改善2型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗机制研究*

赵文嫣1，孙明2，冯勇1，耿东华1，刘金钢3

（1.中国医科大学附属盛京医院1.普通外科，2.泌尿外科，辽宁 沈阳 110004；3.中国医科大学附属第四医院 普通外科，辽宁 沈阳 110032）

目的探讨胃袖状切除术（SG）对2型糖尿病小鼠脂肪组织微囊蛋白1（caveolin -1）表达及胰岛素抵抗的影响。方法实验于2015年1～6月在中国医科大学附属盛京医院中心实验室进行。选择30只肥胖2型糖尿病小鼠（+db/+db，C57BL/KsJ）为研究对象，按体重随机等分为3组：db/db组（无处理）、db/db-SG组（行SG）、db/db-sham组（假手术），每组10只。术前3 d和术后7、14、21及28 d测定动物体重及每100 g体重摄食量。术前5 d和术后30 d，测定小鼠空腹血糖（FBG）及口服葡萄糖耐量（OGTT），ELISA检测血浆胰岛素、三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）；Western blot和实时聚合酶链反应（Real-time PCR）检测内脏脂肪组织caveolin-1、GLUT4蛋白及mRNA表达。结果db/db-SG组小鼠术后体重、摄食量、空腹血糖、OGTT曲线下面积、胰岛素抵抗指数与db/db组及db/db-sham组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），db/db-SG组小鼠术后体重及摄食量降低，空腹血糖下降，OGTT曲线下面积减少，胰岛素抵抗指数下降；db/db-SG组血清TG、TC、LDL水平与db/db组及db/db-sham组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），db/db-SG组小鼠下降；db/db-SG组小鼠脂肪组织caveolin-1、GLUT4蛋白和mRNA表达与db/db组及db/db-sham组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），均升高。结论SG可在术后短期内有效降低2型糖尿病小鼠体重及摄食量，降低TG、TC，改善胰岛素抵抗，可能与脂肪组织caveolin-1及GLUT4水平下降有关。

袖状胃切除；脂肪组织；胰岛素抵抗；脂肪组织微囊蛋白1

胃袖状切除术（sleeve gastrectomy，SG）是常用减重手术的一种，术中切除胃大弯侧80%左右的胃体，减重效果确切。现已有多项研究证实SG可缓解胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）[1-2]，但具体机制尤其是对脂肪组织IR的影响仍不明确。质膜微囊（caveolae）是细胞膜上直径约50～100 nm的烧瓶状内陷区域，具有脂质双层结构，与细胞内外的物质转运、信号转导等事件有关。微囊蛋白1（caveolin-1）是caveolae表面上的标记蛋白，在脂肪细胞中特异性表达[3]。研究发现，在脂肪细胞中胰岛素可诱导GLUT4转位至富含caveolae/caveolin-1的细胞膜上，与其共定位及表达，参与葡萄糖的跨膜转运。鉴于此，本研究以肥胖2型糖尿病小鼠（db/db）为研究对象，探讨SG对脂肪组织IR以及caveolin-1、葡萄糖转运体（GLUT4）表达的影响，为进一步揭示SG改善脂肪组织IR的机制提供新的思路。

1 材料与方法

本实验于2015年1～6月在中国医科大学附属盛京医院中心实验室进行。

1.1 动物分组及处理

选择6～7周龄雄性db/db小鼠（Leprdb，db/db，C57BL/KsJ）30只，均购自南京大学模式动物研究所。术前至少10 d单笼正常饮食饲养。1周后检测db/db小鼠体重及空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），以FBG≥8.0 mmol/L为自发糖尿病模型的入选标准。入选的8周龄肥胖型2型糖尿病小鼠（db/db小鼠）30只按体重随机分为3组：db/db组、db/db-SG组、db/db-sham组，每组均为10只。所有小鼠适应环境1周后开始实验。

1.2 方法

1.2.1 db/db-SG组 行SG。术前6 h禁食水，10%水合氯醛0.3 ml/100 g体重腹腔注射麻醉，固定于操作台，取上腹正中切口1 cm，逐层切开入腹腔探查无异常继续手术，由幽门下至胃底游离大弯侧血管，再由大弯侧向胃底方向切除3/5胃体，残余胃体以6～0无损伤线缝合。关腹前青霉素8万u/100 g体重腹腔注射预防感染，术后4 h进流食（10%葡萄糖），48 h后正常鼠料喂养。

1.2.2 db/db-sham组 麻醉、术前术后给药、进食与db/db-SG组一致，取上腹正中切口1 cm，逐层切开入腹腔探查，胃前壁作0.5 cm切口，原位缝合。db/db-sham组不采取任何处理措施。术后30 d，10%水合氯醛0.3 ml/100 g体重腹腔注射麻醉，下腔静脉采血，留血清-80℃冷冻保存；处死全部小鼠后取附睾脂肪组织-80℃保存。

1.2.3 db/db组 相应指标检测时间与db/db-SG组及db/db-sham组相同，无特殊处理。

1.3 检测指标

①术前3 d和术后7、14、21、28 d测定动物体重及每100 g体重摄食量。②血糖及口服葡萄糖耐量试验（OGTT）：术前5 d和术后30 d血糖仪各测空腹12 h血糖（FBG）1次；术前2 d和术后30 d各测1次OGTT，方法为测FBG后给予50%葡萄糖1.5 g/kg体重灌胃；尾静脉采血，时间点分别为0、30、60、90、120 min。③采用ELISA法检测血浆胰岛素、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）。计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），HOMA-IR=（G0×I0）/22.5，其中 G0为 FBG（mmol/L），I0为空腹血浆胰岛素（μu/ml）。④实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）检测脂肪组织caveolin-1及GLUT4 mRNA表达，扩增条件：95℃ 30s变性，60℃ 30 s退火，72℃ 45s延伸，40个循环，最后72℃延伸5 min。caveolin-1引物，正向：5'-GGGACATCTCTACACTGTTCCCATC-3'，反向：5'-CTTCTGGTTCTGCAATCACATCTTC-3'；GLUT4 引物，正向：5'-CTGTAACTTCATTGTCGGCATGG-3'，反向：5'-AGGCAGCTGAGATCTGGTCAAAC-3'；GAPDH引物，正向：5'-CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC-3'，反 向 ：5'-CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG-3'。 ⑤Western blot法检测脂肪组织caveolin-1及GLUT4表达。

1.4 统计学方法

应用SPSS13.5软件进行统计学处理。各组数据采用均数±标准差（±s）表示，比较采用重复测量设计的方差分析，两两比较采用Student'st检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

全部手术小鼠成活，手术均顺利完成，动物模型复制成功。

2.1 3组小鼠体重比较

采用方差分析比较3组小鼠体重，术前各组小鼠体重差异无统计学意义（F=0.151，P=0.863）。术后7、14、21和28 d各组小鼠体重差异采用重复测量设计的方差分析，结果：①术后3组间小鼠体重差异有统计学意义（F=23.056，P=0.002）；②db/db-SG组内术后7、14、21及28 d体重有差异（F=14.029，P=0.005），db/db组和db/db-sham组各检测时间点体重无差异（F=0.422和0.386，P=0.445和0.563）；③术后小鼠体重随时间推移下降趋势有统计学意义（F=10.009，P=0.000），db/db-SG组小鼠术后7 d内体重下降明显，在检测时间段内，随时间推移呈继续下降趋势。两两比较采用Student'st检验，术后7～28 d db/db-SG组小鼠体重持续下降，与db/db组比较（7 d：t=-3.386，P=0.028；14 d：t=-7.735，P=0.002；21 d：t=-0.596，P=0.010；28 d：t=-5.894，P=0.004），与db/db-sham 组比较（7 d：t=-3.343，P=0.029；14 d：t=-5.495，P=0.005；21 d：t=-4.135，P=0.014；28 d：t=-5.648.386，P=0.010），差异有统计学意义。见表1。

2.2 3组小鼠摄食量比较

采用方差分析比较术前各组间摄食量，差异无统计学意义（F=0.293，P=0.756）。术后7、14、21和28 d各组小鼠摄食量差异采用重复测量设计的方差分析，结果：①术后3组间小鼠摄食量差异有统计学意义（F=5.196，P=0.049）；②db/db-SG组内术后7、14、21和28 d摄食量有差异（F=9.009，P=0.015），db/db组和db/db-sham组各检测时间点摄食量无差异（F=0.521和0.235，P=0.349和0.615）；③术后小鼠摄食量随时间推移下降趋势无差异（F=0.892，P=0.071），db/db-SG组小鼠术后7 d内摄食量下降明显，但随时间推移下降趋势无差异。两两比较采用Student'st检验，db/db-SG组与db/db组比较（7 d：t=-3.864，P=0.018，14 d：t=-2.771，P=0.049；21 d：t=-4.157，P=0.014；28 d：t=2.877，P=0.045） 及db/db-sham组比较（7 d：t=-4.444，P=0.011，14 d：t=-3.169，P=0.034；21 d：t=-2.966，P=0.039；28 d：t=-3.134，P=0.0132）差异有统计学意义。见表2。

2.3 3组小鼠术前、术后FBG、OGTT、HOMAIR比较

术前3组FBG、OGTT曲线下面积、HOMA-IR比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。而术后30 d时db/db-SG组上述3个指标与db/db-sham组和db/db组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两两比较采用Student'st检验，db/db-SG组FBG与db/db组及db/db-sham组比较，均差异有统计学意义（t=-8.419和-7.689，P=0.001和0.002），db/db-SG组FBG下降；小鼠OGTT曲线下面积db/db-SG组与db/db组及db/db-sham组比较，均差异有统计学意义（t=-13.349和-12.579，均P=0.000），db/db-SG组OGTT曲线下面积下降；db/db-SG组HOMA-IR与db/db组及db/db-sham组比较，均差异有统计学意义（t=-12.970和-12.010，均P=0.000），db/db-SG组HOMA-IR下降。见表3。

表1 3组术前、术后体重变化比较 （n =10，g，±s）

表1 3组术前、术后体重变化比较 （n =10，g，±s）

注：1）与db/db组比较，P ＜0.05；2）与db/db-sham组比较，P ＜0.05

db/db 组 52.6±3.6 53.5±2.6 54.6±1.9 55.5±3.6 57.2±3.4 db/db-sham 组 54.1±3.5 52.7±1.9 53.6±2.9 53.8±3.5 54.9±2.6

表2 3组术前、术后摄食量变化比较 （n =10，g，±s）

表2 3组术前、术后摄食量变化比较 （n =10，g，±s）

注：1）与db/db组比较，P ＜0.05；2）与db/db-sham组比较，P ＜0.05

db/db 组 6.6±1.6 6.5±0.9 6.4±1.2 6.9±0.8 6.7±1.4 db/db-sham 组 6.1±1.5 5.7±0.9 6.6±1.1 6.8±1.5 6.2±0.9

2.4 3组术前、术后血浆TC、TG、LDL比较

术前3组TC、TG、LDL比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；术后30 d，db/db-SG组小鼠血浆TC、TG、LDL与db/db组及db/db-sham组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），db/db-SG组水平降低，低于db/db组及db/db-sham组。两两比较采用Student'st检验，db/db-SG组TC与db/db组及db/db-sham组比较，均差异有统计学意义（t=-3.562和-4.082，P=0.022和0.015），db/db-SG组TC下降；db/db-SG组TG与db/db组比较，差异无统计学意义（t=-2.659，P=0.056），与db/db-sham组比较，差异有统计学意义（t=-4.227，P=0.013），db/db-SG组 TG下 降；db/db-SG组 LDL与db/db组及db/db sham组比较，均差异有统计学意 义（t=-3.277和 -2.982，P=0.031和 0.041），db/db-SG组LDL下降。见表4。

2.5 脂 肪 组 织caveolin-1、GLUT4蛋 白 及mRNA表达比较

术后30 d，db/db-SG组小鼠内脏（附睾）脂肪组织caveolin-1、GLUT4蛋白及mRNA表达与db/db组、db/db-sham组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），db/db-SG组表达上调。见附图和表5。

表3 3组术前、术后FBG、OGTT、HOMA-IR比较 （n =10，±s）

表3 3组术前、术后FBG、OGTT、HOMA-IR比较 （n =10，±s）

注：1）与db/db组比较，P ＜0.05；2）与db/db-sham组比较，P ＜0.05

db/db 组 26.6±4.6 25.5±3.8 3 197.8±175.6 3 073.9±256.2 5.0±0.2 5.4±0.3 db/db-sham 组 27.2±5.1 28.6±4.9 3 247.0±217.4 3 170.9±288.8 5.4±0.3 5.2±0.3 db/db-SG 组 24.6±4.9 6.4±1.01）2） 3 137.1±223.5 935.5±106.51）2） 5.3±0.7 2.7±0.21）2）F值 0.234 32.976 0.213 89.589 0.629 92.591

表4 3组术前、术后血浆TC、TG、LDL变化 （n =10，mmol/L，±s）

表4 3组术前、术后血浆TC、TG、LDL变化 （n =10，mmol/L，±s）

注：1）与db/db组比较，P ＜0.05；2）与db/db-sham组比较，P ＜0.05

db/db 组 3.8±0.4 3.8±0.7 1.87±0.55 1.85±0.46 1.91±0.37 1.85±0.45 db/db-sham 组 4.0±0.5 4.0±0.7 1.79±0.47 1.96±0.30 2.01±0.54 1.97±0.47 db/db-SG组 3.6±0.8 2.1±0.41）2） 1.83±0.50 1.09±0.202） 1.89±0.45 0.98±0.231）2）F值 0.945 8.605 0.019 6.057 0.059 5.516

附图 caveolin-1、GLUT4蛋白表达

表5 术后小鼠脂肪组织caveolin-1、GLUT4 mRNA相对表达量 （n =10，±s）

表5 术后小鼠脂肪组织caveolin-1、GLUT4 mRNA相对表达量 （n =10，±s）

注：1）与db/db组比较，P ＜0.05；2）与db/db-sham组比较，P ＜0.05

db/db组 1 1 db/db-sham 组 1.25±0.19 1.19±0.15 db/db-SG 组 3.20±0.31）2） 2.26±0.511）2）F值 194.025 14.695

3 讨论

SG是一种纯粹的限制性减重手术，其不改变胃肠道正常结构，手术切除大弯侧胃体约80%，保留十二指肠起始部、胃幽门、胃小弯和迷走神经的完整性，既达到了胃减容的目的，又能保持相对正常的饮食行为。相比于胃旁路手术等其他吸收不良型减重术式，SG创伤小，围手术期不良事件发生率低，远期并发症少，更加安全、有效。目前，SG多用于对肥胖病人的减重治疗，而对于明确诊断的2型糖尿病病人，胃旁路手术依然是常用术式。但对于一些高龄且合并症多的病人，胃旁路手术风险较高，围手术期病死率高。因此，探讨相对安全的SG对于糖脂代谢异常及IR缓解的机制，具有重要临床意义。

脂肪组织中葡萄糖的跨膜转运是摄取利用的限速步骤，这一过程是由GLUT4介导的[4]。ROS-BARO等[5]认为细胞膜上的caveolae是细胞回摄GLUT4所必须的，且caveolin-1在这一过程中发挥着重要作用。研究表明，caveolin-1失活可能加速GLUT4降解，从而导致胰岛素刺激的葡萄糖转运障碍，是发生IR的原因之一[6]。而且，已有研究发现[7]，caveolin-1可以抑制炎症反应，在脂肪细胞，siRNA下调caveolin-1后，促炎症细胞因子、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6均增加，而抑炎因子白细胞介素-10以及脂联素等的合成和释放则被抑制。caveolin-1对细胞的糖脂转运、内吞、调节炎症因子等生物学过程中均起重要作用。

db/db小鼠是一种自发性肥胖型2型糖尿病模型鼠。本研究对db/db小鼠施行SG后，小鼠短期（30 d）内体重明显下降，摄食量降低，血糖和IR改善，且血清TC、TG、LDL等脂代谢指标亦不同程度好转，提示小鼠术后短期内IR改善，体内糖脂代谢趋于稳定，验证了SG对糖尿病及肥胖的改善作用。脂肪组织是胰岛素作用最主要的靶器官。为了探究SG对脂肪组织IR的影响，本研究检测了术后小鼠附睾脂肪组织，即内脏脂肪组织中caveolin-1、GLUT4蛋白和mRNA表达水平，发现均较未手术和假手术组有不同程度的上升，这可能与手术后体重减轻、IR缓解有关。GLUT4表达的上升提示着葡萄糖转运能力的提高；而caveolin-1的表达上升则可能促进GLUT4的表达和活性增强，并可能抑制脂肪组织炎症通路活性，降低促炎症细胞因子水平，从而使细胞糖脂代谢及内环境趋于稳定。

目前，对于SG改善IR的机制研究有限，但已有资料表明[8-9]，SG对于改善糖脂代谢异常是一种安全、有益的方式。本研究进一步证实了在肥胖2型糖尿病小鼠模型中，SG可以在短期内降低体重及摄食量，降低血糖，改善IR，使糖脂代谢状态至接近正常，而术后脂肪组织caveolin-1、GLUT4表达上升可能与这一现象有关，是SG改善脂肪组织IR的原因之一。

[1]RIZZELLO M, ABBATINI F, CASELLA G, et al. Early postoperative insulin-resistance changes after sleeve gastrectomy[J]. Obes Surg, 2010, 20(1): 50-55.

[2]HADY H R, DADAN J, GOŁASZEWSKI P, et al. Impact of laparoscopic sleeve gastrectomy on body mass index, ghrelin,insulin and lipid levels in 100 obese patients[J]. Wideochir Inne Tech Malo Inwazyjne, 2012, 7(4): 251-259.

[3]BERTA A I, KISS A L, LUKÁTS A, et al. Distribution of caveolin isoforms in the lemur retina[J]. J Vet Sci, 2007, 8(3): 295-297.

[4]LAZER M A. How obesity causes diabetes:not a tall tale[J].Science, 2005, 307(5708): 373-375.

[5]ROS-BARO A, LOPEZ-IGLESIAS C, PEIRO S, et al. Lipid rafts are required for GLUT4 internalization in adipose cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(21): 12050-12055.

[6]GONZÁLEZ-MUÑOZ E, LÓPEZ-IGLESIAS C, CALVO M, et al. Caveolin-1 loss of function accelerates glucose transporter 4 and insulin receptor degradation in 3T3-L1 adipocytes[J].Endocrinology, 2009, 150(8): 3493-3502.

[7]CATALÁN V, GÓMEZ-AMBROSI J, RODRÍGUEZ A, et al.Expression of caveolin-1 in human adipose tissue is upregulated in obesity and obesity-associated type 2 diabetes mellitus and related to in fl ammation. Clin Endocrinol (Oxf), 2008, 68(2): 213-219.

[8]HIMPENS J, DAPRI G, CADIÈRE G B. A prospective randomized study between laparoscopic gastric banding and laparoscopic isolated sleeve gastrectomy:results after 1 and 3 years[J]. Obes Surg, 2006, 16(11): 1450-1456.

[9]ROA P E, KAIDAR-PERSON O, PINTO D, et al. Laparoscopic sleeve gastrectomy as treatment for morbid obesity:technique and short-term outcome[J]. Obes Surg, 2006, 16(10): 1323-1326.

Effect of sleeve gastrectomy on insulin resistance in adipose tissue of obesity-associated type 2 diabetes (+db/+db) mice*

Wen-yan Zhao1, Ming Sun2, Yong Feng1, Dong-hua Geng1, Jin-gang Liu3
(1. Department of General Surgery, 2. Department of Urology, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang, Liaoning 110004, China; 3. Department of General Surgery, the Fourth Aff i liated Hospital, China Medical University, Shenyang, Liaoning 110032, China)

ObjectiveTo observe the effect of sleeve gastrectomy (SG) on the expression of caveolin-1 in adipose tissue and insulin resistance status.MethodsThirty 10-week old obesity-associated type 2 diabetes(+db/+db) (C57BL/KsJ) mice were randomly allocated to db/db-SG group, db/db-sham group and db/db blank control group, each group had 10 rats. Body weight and food intake were recorded 3 d before operation and 7, 14, 21 and 28 d after operation. On the 5th d before operation and the 30th d after operation, FBG and OGTT were detected before and after operation; ELISA was used to detect the plasma insulin, TG, TC and LDL; RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of caveolin-1 and GLUT4 in the viceral adipose tissue.ResultsCompared with the db/db-sham group and the blank control group, the mice in the SG group showed obviously-reduced body weight and food intake (P＜ 0.05), apparent downward trends of FBG level, AUC of OGTT, and HOMA-IR (P＜ 0.05). The plasma TC, TG and LDL levels in the SG group decreased as well (P＜ 0.05). The expressions of caveolin-1 and GLUT4 protein and mRNA in the viceral adipose tissue signi fi cantly increased in the SG group compared to the db/db-sham group and the blank control group (P＜ 0.05).ConclusionsSG can signi fi cantly lower the body weight and food intake, decrease the plasma TC, TG and LDL, and alleviate the insulin resistance status in a short period after surgery, which may be related to reduced expression of caveolin-1 and GLUT4 in the adipose tissue.

gastric sleeve surgery; adipose tissue; insulin resisitance; caveolin-1

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.004

1005-8982（2018）01-0016-05

2017-01-13

沈阳市科学技术计划项目应用基础研究专项（No：150422）；辽宁省自然科学基金（No：2015020505）

耿东华，E-mal：gdh024@126.com

R-332

A

（张蕾 编辑）