硫化氢对糖尿病大鼠心肌纤维化及基质金属蛋白酶7和缝隙连接蛋白43表达的影响

孟艳霞，邓立普

（南华大学附属南华医院 内科，湖南 衡阳 421002）

硫化氢对糖尿病大鼠心肌纤维化及基质金属蛋白酶7和缝隙连接蛋白43表达的影响

孟艳霞，邓立普

（南华大学附属南华医院 内科，湖南 衡阳 421002）

目的探讨硫化氢（H2S）对糖尿病大鼠心肌纤维化及基质金属蛋白酶7（MMP-7）和缝隙连接蛋白43（Cx43)表达的影响。方法将52只SD大鼠随机分为4组，每组13只：糖尿病模型组（STZ组），硫化氢干预模型组（STZ+H2S组），硫化氢干预正常组（H2S组），正常对照组（Control组）。予以链脲佐菌素（STZ）（40 mg/kg）处理STZ组和STZ+H2S，复制糖尿病大鼠模型，复制成功后，每天予以硫氢化钠NaHS溶液（100μmol/kg）处理STZ+H2S组与H2S组，予以等量生理盐水对Control组行腹腔注射，8周后将大鼠处死。VG染色观察4组大鼠心肌组织病理学改变，Western blot检测IV型胶原蛋白、MMP-7、Cx43蛋白的表达。结果STZ组与Control组相比，STZ大鼠心肌细胞排列紊乱明显，细胞间胶原沉积增加，心室肌组织中Ⅳ型胶原蛋白及MMP-7蛋白表达增加（P＜0.05），而Cx43蛋白表达降低（P＜0.05）；STZ+H2S组与STZ组相比，STZ+H2S组心肌细胞排列紊乱有所改善，细胞间胶原沉积减少，心室肌组织中Ⅳ型胶原蛋白及MMP-7蛋白表达也减少（P＜0.05），Cx43蛋白表达上调（P＜0.05）。结论H2S可改善糖尿病大鼠心肌纤维化，其机制可能与通过调控MMP-7上调Cx43蛋白表达有关。

硫化氢；糖尿病；纤维化；基质金属蛋白酶7；缝隙连接蛋白43

糖尿病是一组以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，2013年全球糖尿病患者达3.82亿[1]。近年来，糖尿病患病率在我国逐渐增加，成人糖尿病患病率目前高达9.7%[2]，我国成为全球糖尿病患病率增长速度最快的国家之一[3]。糖尿病可增加急性心血管事件和心源性猝死的发生率，其原因可能与糖尿病患者心室肌的缝隙连接重构和离子通道重构相关。

糖尿病引起的血管损害和代谢异常可导致心肌电生理重构进而引起心肌纤维化和心肌重构[4-5]。细胞缝隙连接广泛存在于细胞间，是心肌细胞间电连接形式，具有维持心肌电生理活动的重要作用，缝隙连接蛋白43（Connexin 43，Cx43）是构成心室细胞缝隙连接的主要蛋白，是心脏正常电活动的关键蛋白。基质金属蛋白酶 7（matrix metalloproteinase，MMP-7）主要表达于心肌细胞和巨噬细胞，属于基质溶解因子。MMP-7可降解细胞外基质中的Ⅳ胶原蛋白、层黏连蛋白、纤黏连蛋白等参与组织重建，同时可能具有降解Cx43的作用。

硫化氢H2S具有改善心室重构、抗炎和抑制氧化应激等作用[5]。而H2S对糖尿病大鼠心肌重构和心室Cx43蛋白的调控作用以及相关机制尚少见研究。本研究拟通过复制糖尿病大鼠模型，观察H2S通过调控MMP-7改善糖尿病大鼠心肌纤维化及上调心肌组织Cx43蛋白表达的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年清洁级雄性SD大鼠52只[购自南华大学动物实验中心；动物合格证号：SYXK（湘）2010-0006]，体重（300±20）g。动物实验在南华大学动物实验中心完成，实验室环境温度12～24℃。分笼饲养，人工照明，白天黑夜各12 h；所有大鼠均可自由获得水和食物。

1.2 主要实验试剂

兔 源MMP-7、Cx43和CollagenIV的 一 抗 和GAPDH一抗购于中国博士德公司，硫氢化钠NaHS购于美国Sigma公司，抗兔二抗购于美国Proteintech公司，BCA蛋白定量试剂盒、细胞裂解液购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验分组及糖尿病模型复制

SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组（Control组）、糖尿病模型组（STZ组）、H2S干预模型组（STZ+H2S组）、H2S干预正常组（H2S组）。STZ+H2S组与STZ组大鼠按体重腹腔注射链脲佐菌素（STZ）（40 mg/kg）；予以链脲佐菌素注射后的24 h内给予5%葡萄糖水防止大鼠发生低血糖休克；予以链脲佐菌素注射72 h后，尾静脉采血测血糖，血糖值＞16.7 mmol/L提示复制模型成功。而后，每天予以硫氢化钠NaHS溶液（100μmol/kg）对H2S组和STZ+H2S组大鼠进行腹腔注射；予以等量生理盐水对Control组和STZ组行腹腔注射，持续8周。Control组、STZ组、STZ+H2S组和H2S组复制模型成功的实验大鼠分别为：12、9、9和10只。

1.4 VG染色光镜下观察大鼠左心室心肌组织病理学形态

取4组大鼠左心室心肌组织，做成切片后，行VG（van gieson）染色，光镜下观察大鼠心肌结构及纤维化程度。

1.5 Western blot检测左心室心肌组织Ⅳ胶原蛋白、MMP-7、Cx43蛋白表达

取4组大鼠左心室心肌组织，提取蛋白并定量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，湿转法将蛋白转至PVDF膜。用TBST配制的5%脱脂牛奶封闭1.5 h，CollagenⅣ、MMP-7、Cx43（稀释度均为1∶400）以及（GAPDH）（稀释度为1∶8 000）一抗37℃孵育1 h后于4℃条件下过夜，TBST缓冲液充分洗膜后用HRP标记的二抗（稀释度为1∶8 000）37℃孵育1 h，ECL显色，曝光后扫描，用Image J图像分析软件进行光密度分析。以目的条带与GAPDH的灰度比值分别表示Ⅳ胶原蛋白、MMP-7和Cx43的蛋白表达水平。

1.6 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示。均数间的比较采用方差分析，有统计学意义后，两组间均数比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌组织VG染色结果

与Control组比较，STZ组大鼠心肌细胞排列紊乱，细胞间明显胶原沉积；与STZ组比较，STZ+H2S组大鼠心肌排列紊乱有所改善，细胞间胶原沉积明显减少。H2S组与Control组比较表现相似。见图1。

图1 4组大鼠心肌组织VG染色结果 （×400）

2.2 H2S对IV型胶原蛋白表达的影响

与Control组Ⅳ胶原蛋白表达水平（0.568±0.027）比较，STZ组大鼠心室肌组织的Ⅳ型胶原蛋白表达水平（0.716±0.026）升高（P＜0.05）；与STZ组比较，STZ+H2S组大鼠心室肌组织的Ⅳ型胶原蛋白表达水平（0.644±0.010）降低（P＜0.05）；H2S组心室肌组织Ⅳ型胶原蛋白表达水平（0.589±0.019）与Control组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

2.3 H2S对MMP-7和Cx43蛋白表达的影响

与Control组MMP-7蛋白表达水平（0.568±0.027）相比，STZ组大鼠心室肌组织的MMP-7蛋白表达水平（0.752±0.010）升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Control组Cx43蛋白表达水平（0.691±0.019）相比，STZ组大鼠心室肌组织的Cx43蛋白表达水平（0.284±0.021）下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

与STZ组MMP-7蛋白表达水平（0.752±0.010）相比，STZ+H2S组大鼠心室肌组织MMP-7蛋白表达水平（0.644±0.010）下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与STZ组Cx43蛋白表达水平（0.284±0.021）相比，STZ+H2S组大鼠心室肌组织Cx43蛋白表达水平（0.772±0.025）升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

H2S组MMP-7、Cx43蛋白表达水平分别为（0.589±0.019）和（0.681±0.023），与 Control组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 H2S对MMP7和Cx43蛋白表达的影响

3 讨论

糖尿病可引起一系列心肌损害导致糖尿病心肌病[6]。糖尿病与急性心血管事件和心源性猝死有密切关系，其原因与糖尿病导致的心肌病变相关，机制可能与心室肌的电生理重构有关，但具体机制目前仍不清楚。缝隙连接蛋白Cx43表达于心室肌相邻细胞的连接处及闰盘部位，其正常表达是心脏电-机械功能及心脏生理功能的保障[7-9]。大量研究发现心室肌Cx43表达下调和分布紊乱可导致心肌复极化的不一致性，从而导致恶性心律失常的发生[10-13]。

糖尿病心肌组织中同时存在MMPs的失调，并与心肌纤维化和心肌重构有关，MMP-7属于基质溶解因子，在心肌细胞和巨噬细胞均可表达。魏英杰等[14]学者在缺血性心肌标本中检测了17种MMPs，发现只有MMP-7、MMP10在心肌组织中明显升高。BOIXEL等[15]发现MMP-7参与了心房组织的早期重构，与正常大鼠相比，急性心肌梗死后的大鼠心肌组织MMP-7表达明显增加。MMP-7可通过降解细胞外基质参与心肌重构，同时研究发现MMP-7参与Cx43重构的调控。当注入MMP-7后正常小鼠也可发生心律失常，在MMP-7基因敲除的小鼠中则未见心电传导异常；与野生型小鼠相比，沉默MMP-7基因表达的小鼠，其心肌梗死的心肌组织Cx43表达增加近1倍，同时作者在体外实验也证实了Cx43正是MMP-7的酶解底物[16]。本研究发现糖尿病大鼠心室肌存在明显心肌纤维化，IV型胶原蛋白表达增加，心室肌组织Cx43蛋白表达下调，而组织中MMP-7蛋白表达上调，提示糖尿病大鼠心室肌MMP-7的上调可直接促进心肌细胞Cx43降解，进而导致糖尿病大鼠心肌的电生理重构和心律失常的发生。

本研究结果提示，H2S可通过抑制心肌组织MMP-7的表达上调心肌组织Cx43蛋白的表达，这一作用可能与其改善糖尿病大鼠心肌纤维化相关。更改作用机制可能为临床防治糖尿病心肌病的发生、发展提供新的靶点。但H2S通过调控MMP-7上调心室肌组织Cx43蛋白表达的具体调控机制尚不清楚，其与H2S改善糖尿病大鼠心肌纤维化这一作用的内在关系也需要进一步研究。

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Effect of hydrogen sul fi de on myocardial fi brosis and MMP7 and connexin 43 expressions in diabetic rats

Yan-xia Meng, Li-pu Deng
(Department of Medicine, the Aff i liated Nanhua Hospital, South China University,Hengyang 421002, Hunan, China)

ObjectiveTo investigate the effect of hydrogen sul fi de on myocardial fi brosis and the expressions of connexin 43 (Cx43) and MMP7 in diabetic rats.MethodsFifty-two rats were randomly divided into four groups(13 in each): diabetes mellitus group (STZ group), diabetes mellitus treated with H2S group (STZ+H2S group), normal rats treated with H2S group (H2S group) and control group. The STZ group and the STZ+H2S group were treated with Streptozotocin according to the standard of 40 mg/kg to make diabetes model. After the modeling, NaHS (the provider of H2S, 100 μmol/kg) was administered to the rats of the STZ+H2S group and the H2S group every day; the rats in the control group were injected with equal amount of saline into peritoneal cavity. After 8 weeks, the pathological changes of myocardium in the four groups were observed by VG staining. The expression levels of collagen IV,MMP7 and Cx43 were analyzed by Western blot.ResultsCompared with the control group, the expression levels of collagen IV and MMP7 in the myocardial tissue were signi fi cantly increased (P＜ 0.05), while the expression level of Cx43 protein was signi fi cantly decreased in the STZ group (P＜ 0.05), accompanied by disorder of myocardial cells. Compared with the STZ group, the expression levels of collagen IV and MMP7 protein in the myocardial tissue were signi fi cantly decreased in the STZ+H2S group (P＜ 0.05), while the expression level of Cx43 was signi fi cantly increased (P＜ 0.05) and the disorder of myocardial cells was improved.ConclusionsHydrogen sul fi de could reduce myocardial fi brosis in diabetic rats, which may be related to the upregulation of connexin 43 expression by MMP7.

hydrogen sul fi de; diabetes; fi brosis; matrix metalloproteinase 7; connexin 43

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.005

1005-8982（2018）01-0021-04

2017-01-23

邓立普，E-mail：1456608926@qq.com；Tel：18907345315

R-332；R587.1

A

（张西倩 编辑）