盐酸法舒地尔脂质体的制备①

(1.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007;2.佳木斯市疾病预防控制中心，黑龙江 佳木斯 154007)

盐酸法舒地尔脂质体的制备①

(1.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007;2.佳木斯市疾病预防控制中心，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：制备盐酸法舒地尔脂质体，探讨制备盐酸法舒地尔脂质体的最优处方及最佳制备工艺。方法：采用醋酸钙梯度法制备盐酸法舒地尔脂质体。以包封率为考察指标，在单因素实验基础上，通过正交试验优化最优处方及最佳制备工艺，采用紫外分光光度法对盐酸法舒地尔脂质体包封率进行测定。结果：最终确定制备盐酸法舒地尔脂质体的最优处方及最佳制备工艺为药脂比1:20、孵育时间1.5h、醋酸钙浓度100mmol/L、孵育温度45℃，所制备的盐酸法舒地尔脂质体包封率达80.94%。结论:醋酸钙梯度法制备盐酸法舒地尔脂质体方法可行，所制得载药脂质体包封率达到制剂学要求，且重现性好。

盐酸法舒地尔；脂质体；醋酸钙梯度法；包封率

盐酸法舒地尔具有广泛的抗纤维化作用。盐酸法舒地尔其化学名为：六氢-1-(5-磺酰基异喹啉)-1(H)-1, 4二氮-杂盐酸盐，分子式：C14H17N3O2SHCl，分子量为327.83，为白色、类白色或微黄色的结晶性粉末。无臭、微苦，有引湿性。极易溶于水，溶于甲醇。pH值为4.5～6.0。是1999年由日本旭化成株式会社上市的商品名为Eril的新型的钙拮抗的血管扩张剂[1]。盐酸法舒地尔是目前唯一用于临床治疗的Rho激酶抑制剂，Rho激酶在多种细胞发挥功能作用中有参与。盐酸法舒地尔可以通过阻断Rho激酶通路影响多种细胞发挥其功能，近而发挥其广泛的药理作用。盐酸法舒地尔对于急性脑梗死预后改善[2]、蛛网膜下腔出血[3]、椎-基底动脉供血不足、血管痉挛[4]、心力衰竭、心绞痛[5]等都能够产生治疗作用。深入病例研究中发现，盐酸法舒地尔在抑制肺、肝、心脏纤维化及尿道瘢痕等发病过程中起到了一定的抑制和改善作用。本实验旨在制备盐酸法舒地尔脂质体，探讨制备的最优处方及最佳制备工艺，为盐酸法舒地尔微粒制剂的研究与开发提供参考。

1 仪器及材料、试剂

1.1 仪器

FA2004 电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；LE-80K型超高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；UV-2550紫外分光光度计(日本岛津)；RE-3000A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；KQ-200KDB 型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料和试剂

盐酸法舒地尔原料药(上海源叶生物科技有限公司)；盐酸法舒地尔对照品(上海源叶生物科技有限公司)；大豆卵磷脂(上海源叶生物科技有限公司)；胆固醇(上海源叶生物科技有限公司)；三氯甲烷(分析纯)；磷酸氢二钠(分析纯)；磷酸二氢钠(分析纯)；甲醇 (分析纯)；硫酸铵(分析纯)；醋酸钙(分析纯)；pH6.5PBS(0.1mol/L，实验室自制，分析纯)。

2 实验方法与结果

2.1 盐酸法舒地尔脂质体的制备方法

采用醋酸钙梯度法制备盐酸法舒地尔脂质体，精密称取一定量的胆固醇和磷脂，用适量的三氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪35℃减压蒸除有机溶剂成薄膜，加入一定浓度的醋酸钙溶液20mL使薄膜脱落溶解，40℃常压下水化1h使其均匀分散，制得空白脂质体混悬液。以0.9%氯化钠溶液为透析液，将制得的空白脂质体混悬液透析至最适宜载药pH值梯度范围，称取适量药物置于透析过的空白脂质体混悬液中，在一定温度下进行孵育。即制得盐酸法舒地尔脂质体混悬液。

2.2 正交试验设计

在单因素实验考察基础上，采用正交试验设计，筛选影响脂质体包封率的4个主要因素，每个因素设3个水平进行正交试验设计。正交试验因素水平见表1。

表1 因素水平表

以包封率为评价指标，以L9(34)正交表安排试验。正交试验结果见表2。

表2 L9(34)正交试验结果

表3 方差分析结果

由表2结果显示，在本实验所选取的因素和水平中，最优处方及最佳制备工艺为A1B3C3D3，即主药与磷脂质量比为1:20、孵育时间为1.5h、醋酸钙溶液浓度为100mmol/L、孵育温度为45℃。由表3分析结果显示，极差值越大，该因素影响越明显，各因素影响的主次顺序B>C>D>A。

2.3 盐酸法舒地尔含量分析方法的建立

2.3.1 检测波长的确定

本文采用紫外分光光度法对盐酸法舒地尔脂质体中盐酸法舒地尔的含量进行测定。精密称取盐酸法舒地尔5mg用甲醇溶解并定量稀释成一定浓度的盐酸法舒地尔甲醇溶液，根据《中国药典》2015版中记载，盐酸法舒地尔在275nm、312nm、324nm处均有紫外吸收峰，取盐酸法舒地尔甲醇溶液在紫外波长200～300nm进行紫外扫描，见图1。

图1 盐酸法舒地尔紫外扫描图

2.3.2 标准曲线的绘制

精密称取盐酸法舒地尔标准品10mg，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。即得100μg/mL的贮备液，分别精密量取贮备液0.60、0.90、1.50、2.40、3.00、4.50、5.40mL于10mL容量瓶中，甲醇稀释定容，以甲醇作为空白，于275nm处分别测定吸光度，以浓度(C)对吸光度(A)作线性回归，绘制标准曲线，标准曲线见图2。得回归方程：A=0.0187C-0.0106(R2=0.9995)。结果表明：盐酸法舒地尔在6.00～54.00μg/mL浓度范围内，浓度对吸光度呈良好线性关系，符合Lanbert-Beer规则。

图2 盐酸法舒地尔含量测定的标准曲线

2.3.3 精密度

分别精密配制6.00、30.00、54.00μg/mL低、中、高三个浓度的供试品溶液，分别于275nm处紫外测定吸光度，1d内连续测定6次，连续测3d。计算日内RSD及日间RSD，取平均值。日内RSD为0.61%，日间RSD为1.1%。

2.3.4 回收率

分别精密配制6.00、30.00、54.00μg/mL低、中、高三个浓度的供试品溶液，分别于275nm处紫外测定吸光度，同一天内测定3次，计算回收率，其平均回收率为99.49%，RSD为0.24%。

2.4 盐酸法舒地尔脂质体包封率的测定

精密量取载药脂质体混悬液1mL置于2mL的离心管中，高速冷冻离心机4℃、12000r/min、离心2h，取上清液0.5 mL置于10mL容量瓶中甲醇稀释定容，经紫外测定，记录吸光度(A)值，代入标准曲线中，计算出样品中游离盐酸法舒地尔的浓度C游；另精密量取同一批载药脂质体混悬液1mL置于2mL离心管中，加入0.5mL甲醇溶液，超声15min破膜，高速冷冻离心机4℃、12000r/min、离心2h，取上清液0.5mL置于10mL容量瓶中甲醇稀释定容，经紫外测定，记录吸光度(A)值，代入标准曲线中计算样品中盐酸法舒地尔的总浓度C总；按照下式计算出盐酸法舒地尔脂质体的包封率：包封率=(1-C游/C总)×100%。测得3批样品平均包封率为(81.24±3.45)%。

3 讨论

3.1 盐酸法舒地尔脂质体制备方法的选择

盐酸法舒地尔为弱酸性、水溶性药物，目前，采用薄膜分散法等所制备的载水溶性药物脂质体的包封率较低，为提高载药脂质体包封率，本文通过比较筛选，最终确定采用pH梯度法中的醋酸钙梯度法制备盐酸法舒地尔脂质体，在单因素实验基础上，通过正交试验设计优化处方及制备工艺，最终确定了制备盐酸法舒地尔脂质体的最优处方及最佳制备工艺。该方法操作简单，适用于弱酸性、水溶性药物盐酸法舒地尔载药脂质体的制备，且包封率达到制剂学要求，方法重现性好。

3.2 透析除盐法在醋酸钙梯度法制备盐酸法舒地尔脂质体过程中的应用

在考察醋酸钙梯度法的pH梯度过程中，采用透析除盐的方法，在透析过程中，要求操作严格缜密，考察透析液加入量、透析时间等因素的影响，以确保透析操作产生的pH梯度达到高包封率的条件，并保证实验的重复性良好。同时，醋酸钙梯度法制备盐酸法舒地尔脂质体过程中，采用透析法作为除盐方法，方法简便，易于操作。

[1]孟祥军, 齐杰, 田莉. 盐酸法舒地尔的合成、药理和临床研究进展[J]. 沈阳医学院学报, 2010, 12(1): 45-50

[2]庄礼源. 盐酸法舒地尔在改善脑梗死患者预后中的作用研究[J]. 中外医学研究, 2017, 15(9): 101-103

[3]辜勇. 盐酸法舒地尔早期预防蛛网膜下腔出血术后脑血管痉挛51例疗效评价[J]. 中国药业, 2015, 24(23):37-38

[4]焦洋, 周云松, 熊葶. 盐酸法舒地尔治疗蛛网膜下腔出血所致脑血管痉挛的临床分析[J]. 临床医学研究与实践, 2017, 4(10):15-16

[5]滕震. Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔治疗不稳定型心绞痛的疗效观察[D]. 河北医科大学, 2012

Thepreparationoffasudilhydrochlorideliposomes

HUYan-qiu1,HUJun-hua2,SUNChang-hai1,ZHANGYun-jie1,CHAIJia-li1,LIUWen-wen1

(1.College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2.Jiamusi Center for Disease Control and Prevention, Jiamusi 154007, China)

ObjectiveTo prepare and discuss optimal prescription and the best preparation process for fasudil hydrochloride liposomes.MethodThe fasudil hydrochloride lipsomes were prepared by calcium acetate gradient method. Based on the single factor experiment, the optimum formulation and optimum preparation were optimized by orthogonal design. The encapsulation efficiency of fasudil hydrochloride lipsomes were determined by ultraviolet-visible spectrophotometry.ResultsThe optimum formulation and optimum preparation for fasudil hydrochloride liposomes were as follows: the proportion of fasudil hydrochloride and lipids in weight was 1:20, incubation time was 1.5h, the concentration of calcium acetate was 100mmol/L, incubation temperature was 45°C. The encapsulation efficiency of fasudil hydrochloride liposomes were 80.94%.ConclusionsCalcium gradient preparation of fasudil hydrochloride liposome method is feasible, the prepared drug loaded liposomes reached the requirements of pharmaceutics, and had good reproducibility.

fasudil hydrochloride; liposome; calcium acetate gradient method; encapsulation efficiency

1.黑龙江省大学生创新创业训练计划项目，编号：201510222006;2.佳木斯大学基础研究类(自然类)面上项目，编号：JMSUJCMS2016-068；3.黑龙江省卫生计生委科研课题，编号：2016-323。

胡艳秋(1983～)女，黑龙江双鸭山人，硕士，讲师。

胡俊华(1985～)男，黑龙江双鸭山人，学士，主管药师。E-mail: huyanqiu8392@163.com。胡艳秋1，胡俊华2，孙长海1，张云杰1，柴佳丽1，刘文文1

R285.5

A

1008-0104(2017)06-0028-03

2017-05-18)