微波提取无花果叶中的总黄酮及其体外抗氧化活性研究

崔鹏，陈志冉，史雷革

（1.黄河水利职业技术学院环境与化学工程系，河南开封475004；2.开封市绿色涂层材料重点实验室，河南开封475004）

微波提取无花果叶中的总黄酮及其体外抗氧化活性研究

崔鹏1，2，陈志冉1，史雷革1

（1.黄河水利职业技术学院环境与化学工程系，河南开封475004；2.开封市绿色涂层材料重点实验室，河南开封475004）

采用微波法提取无花果叶中的总黄酮，考察乙醇体积分数、液料比、提取功率、提取时间对总黄酮提取率的影响，并进行四因素四水平正交试验，得到总黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数90%，液料比55∶1（mL/g），提取功率200 W，提取时间3min，黄酮的含量为20.56mg/g；该提取物对DPPH自由基去除率达66.67%，羟基自由基去除率达30.49%，证明其具有较好的体外抗氧化能力。

无花果叶；正交试验；黄酮；抗氧化性

无花果为落叶灌木或乔木。分布在我国中部、西北部、南部诸省。无花果种植历史悠久，有极高的营养价值，除果实外其叶药用价值也很高。文献详述无花果叶的药理性，其具有抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗菌、抗病毒等[1]。无花果叶中含有黄酮类物质、香豆类物质、维生素C、氨基酸、蛋白质等化学成分[2]。目前常见的黄酮类物质提取方法有溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超临界CO2萃取法[3-4]。其中溶剂提取法时间长，操作繁琐，不适用于规模生产；超声波法耗时短，简单易行，但容易形成超声空白区影响提取效率[5-9]；超临界CO2萃取法提取率高、提取物纯度高，无污染，但其所需设备成本高，运行成本昂贵；而微波法因耗时短，提取效率高，成本适中成为目前研究的热点[10-13]。黄酮的测定方法常见的有三氯化铝比色法和亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠分光光度法，前者因不能排除非黄酮类物质的干扰存在局限性；后者稳定性较高抗干扰能力强，是目前应用广泛的检测方法[14-20]。因此，选择微波辅助进行提取，亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠分光光度法检测黄酮的含量，并用正交试验对相应试验条件进行探讨，为开发利用无花果叶提供部分参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无花果叶：市售；芦丁标准品（色谱纯）：中国食品药品检定研究院；无水C2H5OH（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：天津市德恩化学试剂有限公司；亚硝酸钠（分析纯）：天津登科化学试剂有限公司；硝酸铝（分析纯）：天津恒兴化学试剂制造有限公司；过氧化氢（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；硫酸亚铁（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；水杨酸（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；1，1-二基-2-苦基肼自由基（DPPH）（分析纯）：如吉生物科技。

1.2 仪器与设备

ISO9001超声微波组合反应系统：南京先欧仪器制造有限公司；FA2004N电子分析天平：上海精密仪器有限公司；V-1200紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；101-1A电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

样品：清洗，烘干，破碎，过200目筛，存于棕色瓶中备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

芦丁标准溶液浓度为0.20mg/mL。

标准曲线的绘制：吸量管吸取不同体积（mL）芦丁标准液于10mL的比色管，分别加入0.40 mL5%亚硝酸钠溶液，0.40 mL10%硝酸铝，摇匀放置5min后加入2.00 mL4%氢氧化钠，并用浓度30%无水乙醇定容。在波长为505 nm条件下，以同样浓度的乙醇作空白，测定吸光度。以芦丁标准品质量浓度C（mg/mL）和吸光度A为横、纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程：Y=1.6X-0.010 3，R2=0.999 3（n=6）。该标准曲线在 0～10mg/L范围内呈线性关系。

1.3.3 总黄酮类物质的提取

称取1.000 0 g待测样，加入不同体积分数的提取液，选择不同的液料比及提取温度，提取时间后过滤转移定容，得到黄酮提取液，低温保存。

1.3.4 总黄酮类物质提取率的计算

吸黄酮提取液0.20mL～10mL比色管，分别加入0.40 mL5%亚硝酸钠溶液，0.40 mL10%硝酸铝，摇匀放置5min后加入2.00 mL4%氢氧化钠，并用浓度30%无水乙醇定容，测定吸光度。代入方程得黄酮类成分的含量。黄酮提取率的计算公式如下：

式中：ρ为黄酮类物质提取率，mg/g；C为黄酮质量浓度，mg/mL；V为总黄酮提取液体积，mL；m为样品质量，g。

1.3.5 黄酮提取条件优化单因素试验

设计单因素试验条件，考察不同因素对无花果叶中黄酮提取率的影响，具体见表1。

表1 单因素试验条件Table 1 Experimental conditions of single-factor

1.3.6 优化正交试验条件

在单因素试验的基础上，确定提取液料比、微波功率、C2H5OH浓度、提取时间，设计四因素四水平正交试验，探索最佳试验参数。

1.3.7 无花果黄酮抗氧化性试验

以DPPH自由基和·OH自由基的去除率来考察无花果叶中黄酮的抗氧化性。

1.3.7.1 DPPH自由基的去除

配制浓度是0.2 g/L DPPH溶液，冷冻避光保存待用。取不同浓度样品2mL，加入浓度为0.2mg/mL DPPH溶液，摇匀，避光反应20min。以无水乙醇做参比，于515 nm测定吸光度。去除率公式为：

式中：Ai为DPPH溶液吸光度值；Ax为样品液和DPPH溶液吸光度值；Ae为不含DPPH溶液时样品液吸光度值。

1.3.7.2 ·OH的去除

参照贾之慎[21]等方法有部分改动，采用水杨酸比色法测定羟基自由基去除率。取不同浓度梯度样品1mL，加入2mL硫酸亚铁，1.5mL水杨酸，再加入0.1mL过氧化氢启动反应。以蒸馏水做参比，于510 nm测定吸光度。去除率公式为：

式中：A0为生成的羟基自由基溶液吸光度值；A1为样品液和生成羟基自由基溶液吸光度值；A2为样品液吸光度值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对无花果黄酮提取率的影响

称取1.000 0 g待测样，依据单因素试验条件序号Ⅰ进行试验。测定、计算黄酮提取率见图1。

图1 乙醇浓度对无花果叶黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of concentration of ethanol on the extraction rate of flavonoids from Ficus carica leaves

由图1可以看出，提取率随乙醇浓度的增大逐渐提高，在乙醇浓度90%时提取率最高，确定此点为最佳乙醇浓度。

2.1.2 液料比对无花果黄酮提取率的影响

称取1.000 0 g待测品，依据单因素试验条件序号Ⅱ进行试验。测定、计算黄酮提取率见图2。

图2 液料比对无花果叶黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ratio of liquid to material on the extraction rate of flavonoids from Ficus carica leaves

由结果图2可以看出，提取率随液料比的升高逐渐增大并在55∶1（mL/g）时最高，继续增加反而降低，分析原因可能是由于液料比增加使得待测物中黄酮类物质浓度减少从而提取率降低造成。因此确定55∶1（mL/g）为最佳液料比。

2.1.3 微波时间对无花果黄酮提取率的影响

称取1.000 0 g待测物，依据单因素试验条件序号Ⅲ进行试验。测定、计算黄酮提取率见图3。

图3 微波时间对无花果叶黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of microwave time on the extraction rate of flavonoids in Ficus carica leaves

由结果图3可以看出，提取率随着微波时间增大而增大，在微波时间4min时最高，继续增加提取率反而下降。由于微波时间较长时，乙醇被蒸干情况严重，导致提取率下降。

2.1.4 微波功率对无花果黄酮提取率的影响

称取1.000 0 g待测品，依据单因素试验条件序号Ⅳ进行试验。测定、计算黄酮提取率见图4。

图4 微波功率对无花果叶黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of microwave power on the extraction rate of flavonoids in Ficus carica leaves

由结果图4可以看出，随着提取时间的增加提取率逐渐增大，在微波功率400 W时最高，微波功率继续增大提取率下降明显，推测是由于提取温度随着提取功率的增大而升高，C2H5OH挥发的越快，从而影响试验效果，因此选择400 W为最佳微波功率。

2.2 正交试验结果

为确定本试验的最佳条件，采用正交试验方法测定。称取待测物1.000 0 g共16份，按照正交试验表2进行试验。

表2 黄酮提取条件优化正交试验结果与分析Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for flavonoids extraction conditions optimization

试验结果显示，黄酮成分提取率受各因素的影响次序：C2H5OH浓度A＞液料比C＞微波功率D＞微波时间B。最佳方案是A3B1C3D1，即C2H5OH浓度90%，微波时间 3min，液料比 55 ∶1（mL/g），微波功率 200 W。该试验条件未在单因素试验及正交试验中出现，进一步对该方案进行验证，依照上述试验条件重复提取5次进行测定计算，结果如下：提取率分别是21.10%、20.98%、21.12%、20.93%、21.07%，相对标准偏差为0.45%。平均值高于正交试验中的任一提取率，说明此方案可实施性较强。

2.3 抗氧化试验结果

2.3.1 DPPH自由基的去除试验

按照1.3.7.1步骤进行DPPH自由基去除试验，并计算去除率见图5。

图5 无花果叶提取液浓度对DPPH自由基去除率影响Fig.5 DPPH radical scavenging activity of different extract concentrations from Ficus carica leaves

图5显示当样液浓度越大对DPPH自由基去除率越大，呈正相关，在7mg/mL时，对DPPH自由基去除率达到66.7%，样液浓度在7mg/mL～10mg/mL时对DPPH自由基去除率相接近。无花果叶黄酮提取液具有一定的抗氧化性。

2.3.2 ·OH的去除试验

按照1.3.7.2步骤进行·OH去除试验，并计算去除率见图6。

图6 无花果叶提取液浓度对·OH去除率的影响Fig.6·OH scavenging activity of different extract concentrations from Ficus carica leaves

图6显示当样液浓度增大，去除率也逐渐增大，在样液浓度为8mg/mL时去除率达到最大30.49%，样液浓度在8mg/mL～10mg/mL之间时·OH自由基去除率近似相等。

3 结论

1）本试验研究对象为无花果叶子，采用正交试验方法进行，对无花果叶黄酮类成分的提取即含量测定进行探讨，确定最佳提取条件。试验结果表明，试验中选取因素的主次关系为C2H5OH浓度＞液料比＞微波功率＞微波时间，最佳条件：C2H5OH浓度90%、微波时间3min、液料比 55 ∶1（mL/g）、微波功率 200 W，无花果叶中黄酮类物质提取率为20.56mg/g。结果显示无花果中黄酮类成分含量丰富。

2）进行体外抗氧化性试验得出，无花果叶提取液对DPPH自由基去除率达66.67%，对·OH去除率达30.49%，证明无花果叶中黄酮类成分有较强的抗氧化能力，可以抑制癌细胞的增长、提高机体免疫能力，对细胞过氧化衰老有一定抑制作用。

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Microwave Extraction and Free Radical Scavenging Activity of Total Flavonoids from Ficus carica Leaves

CUI Peng1，2，CHEN Zhi-ran1，SHI Lei-ge1
（1.Department of Environment and Chemical Engineering，Yellow River Conservancy Technical Institute，Kaifeng 475004，Henan，China；2.Key Laboratory of Green Coating Materials of Kaifeng City，Kaifeng 475004，Henan，China）

Microwave-assisted flavonoids extraction from Ficus carica leaves and the best experimental conditions were studied.Total flavonoids were determined in Ficus carica leaves.The result showed that the optimal extraction condition as follows：alcohol concentration was 90%，material-water ratio was 55 ∶1mL/g，extraction power was 200 W，reflux time was 3min and the flavonoid extraction rate from Ficus carica leaves were 20.56mg/g.The extract showed that the DPPH clearance rate was 66.67%，the removal of·OH was 30.49%，it was proved that it had good anti-oxidative activity.

Ficus carica leaves；orthogonal experiment；flavonoids；antioxidative activity

崔鹏，陈志冉，史雷革.微波提取无花果叶中的总黄酮及其体外抗氧化活性研究[J].食品研究与开发，2018，39（1）：41-45

CUI Peng，CHEN Zhiran，SHI Leige.Microwave Extraction and Free Radical Scavenging Activity of Total Flavonoids from Ficus carica Leaves[J].Food Research and Development，2018，39（1）：41-45

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.009

崔鹏（1977—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：化学化工、环境领域的教学与研究工作。

2017-09-08