微观世界的可视化显微镜发展的历史征程

文/ Ilka Ottleben

微观世界的可视化显微镜发展的历史征程

文/ Ilka Ottleben

图1 从这里开始——19世纪耶拿光学仪器生产作坊

19世纪中叶，德国耶拿市——一座被歌德先生恭恭敬敬称之为“科学堆建而成的城市”，主要由科研机构、大学和与科学技术相关的生产作坊构成。那一时期，科学和医学突飞猛进，科研人员开始理解生物有机体的基本结构，“细胞”这一专业术语的含义越来越多。

在这样的环境中，30岁的卡尔·蔡司先生（1816年至1888年）于1846年11月17日在耶拿市Neugasse街7号开设一间从事精密机械和光学仪器的生产作坊——也是具有170多年历史蔡司公司的摇篮和奠基石。

探索微观世界

显微镜的历史可以追溯至17世纪中叶，这一悠久历史告诉我们：人的本性就是要不断探索微观世界。19世纪初，一种博得达官贵人更多欢乐的小玩意变成科学研究和医学研究中的重要利器，凸显其在科研领域中的重要性。1847年，卡尔?蔡司听取从前他老师、植物学家和细胞理论奠基人之一的Mattias Jacob Schkeiden先生(1804～1881)的建议开始生产制造简单但很精确的显微镜。由于他的勤奋和努力使他很快小有名气，纷至沓来的订单和需求同样证实他当初的决定完全正确。将显微镜叠放在一起能够实现较大的放大倍数。为了在竞争中不输给竞争对手，蔡司先生于1857年开始制造复合显微镜——Stativ I成为这家公司的技术里程碑。

当时获取显微镜镜头非常麻烦：典型的镜头选配方法就是要将不同无色透明镜片进行分组“适配”，通过不同的镜头组合选配寻找到最佳的一组，这完全破坏了显微镜的生产稳定性，也不利于提高显微镜的光学质量。认识到需要在坚实的科学基础之上制造显微镜是卡尔·蔡司的基本功绩之一。在显微镜的研发过程中与科学家们密切合作是卡尔·蔡司一个具有里程碑意义的决定，也是公司发展的基本原则之一，他与耶拿大学物理学讲师Ernst Carl Abbe先生（1840年至1905年）进行了多年富有成效的合作。1866年，蔡司先生首先聘请他担任公司的科研人员，从1876年起成为企业的隐名股东。

早期的开路先锋

Abbe先生于1860年年底在蔡司公司完成光学系统计算，成果具有开创性，同样奠定了显微图像理论——阿贝成像原理基础。阿贝分辨率极限定理告诉我们：能够被光学分辨的两点间的距离总是大于波长的一半。他在自己的一系列试验中发现了能够围绕光轴形成清晰图像的（阿贝）正弦条件，并提出了数值孔径（N.A.）的概念。

他根据这些研究认识得出结论：在最佳条件下，通过使用紫外光和1.4数值孔径光学显微镜理论上能够实现的分辨率为0.2 μm。

从1872年开始，蔡司公司开始生产制造基于科学计算基础的光学显微镜——明显具有更好的光学性能。1877年，公司生产出第一台油浸物镜光学显微镜，奠定了当前几乎所有的实验室用油浸物镜显微镜基础，明显提供更高的检测分辨率。

从那时起，Ernst Abbe先生便有能力计算显微镜数据、避免重要的数据错误。根据他掌握的知识：光学镜头的质量限制显微镜应用。年轻化学家Otto Schott先生（1851年至1935年）发明出一种适用于制造光学镜头的新玻璃同样证明了该事实。他们一起于1882年在耶拿成立了玻璃技术实验室。随后的工作就是生产制造质地均匀、尺寸准确、具有良好光学性能的玻璃镜头。1886年，面目全新的、采用复消色差物镜的显微镜首次上市，这是一块坚实的里程碑。

科研先锋

光学理论基础知识不仅保证蔡司公司在技术上明显优于竞争对手，而且在自然科学和医学领域中具有开创性突破。Robert Koch先生于1880年发现肺结核和霍乱病原体并因此获得1905年诺贝尔医学奖。他在1804年写给卡尔·蔡司的一封信中表明：“我对自己在科学研究领域中所获得的成就向您表示感谢，您发明的出色显微镜功不可没。”

在随后的1906年里，西班牙的神经科学和组织学家Ramon Y Cajal与Camillo Golgi同样因他们在物理学和医学领域中对神经系统的结构和精细的神经系统发明所做贡献获得诺贝尔奖。在他们的科研工作中，Cajal先生使用的就是蔡司公司生产的显微镜。时至今日，已经有超过30名的诺贝尔奖获得者使用的是蔡司公司的技术产品。

以科研和工业化生产密切合作为基础，以研究微观世界、打破人类肉眼视觉界限为目标进一步推动科学技术发展是蔡司公司缔造者蔡司先生和Abbe先生在企业摇篮时期定下的原则。1889年，在Abbe先生逝世一周年后，该原则同样写入了蔡司先生创立的卡尔·蔡司基金会章程中；1891年，他又将自己的资产捐给光学仪器生产厂和耶拿玻璃厂；为耶拿大学的科学研究提供帮助。时至今日，蔡司股份公司每年都拿出一定的股息投入到卡尔·蔡司基金会去，促进科研和教学。

日益增加的多样性

19世纪末，显微镜已不再只是科学研究中的重要工具，它同样发展成为医疗、卫生和材料检验日常工作中的常规仪器设备。1884年第一家成立于英国伦敦的分公司标志着蔡司公司全球扩张的开始。

1896年，蔡司公司应美国昆虫学家Horatio S. Greenough先生要求设计制造第一台立体显微镜。从这一年起，蔡司公司开始按照用户需求生产制造量身定制的专用显微镜，从中学到的知识和技术被应用于其他产品的设计与生产之中，例如，用于望远镜、摄影镜头、天文学仪器设备、分光仪或大地测量仪器设备中，为企业开辟新的经营领域。

1904年， 由 August Köhler先 生和Mortz von Roht先生发明的紫外线显微镜和由Köhler先生安装制造、Henry Siedentopf先生1908年改进完善的荧光显微镜进一步扩大光学显微镜的可利用光源。

第一次世界大战暂时中断了“民用仪器设备”的研发工作，到1933年，著名的L-Stativ成为显微镜中的典范。在蔡司公司发展的历史长河中，德国的分裂和统一是公司发展过程中两个重要历史时期。

位相衬度的发明

在光学显微镜技术领域中，众所周知的阿贝分辨率极限为0.2微米。典型的动物细胞直径在10-20微米之间，比肉眼可见的最小微粒小五倍，但却能够被光学显微镜分辨出来。看清动物细胞结构并了解各种细胞组成部分的功能更加困难，再加上动物细胞无色、透明，几乎不吸收任何光线，细胞学家担心：通过细胞固定与染色可能会改变细胞的组成（和功能）或使其丢失。从细胞生物学的角度出发追溯显微镜的发展历史可以快速了解：科学技术的进步曾经依靠的是新对比法，而不是新辐射源发展。

这些恰恰是蔡司公司需要解决的问题：在透明物体高对比度检测技术的突破中与荷兰物理学家Fritz Zernike先生合作开发具有极大帮助。Zernike先生在1930年利用反射式衍射光栅进行工作时发现：可观测到单独光束的相位位置。为在显微镜中能够利用该效应，他与蔡司公司合作开发出第一台相衬显微镜：1936年诞生第一台样机。利用该种相衬显微镜可以观察活体细胞，不会因染色使细胞受损。

需要自动化

显微镜用户的最大问题是什么？蔡司公司怎样才能帮助用户解决他们遇到的难题？早在20世纪30年代，相机便能简化显微图像定影和文字记录，该技术进步能够将用户从繁琐的、非常不准确的显微图像缩写签字中解放出来。随着技术的不断进步，电子产品凭借其先进的功能进一步实现显微检测技术领域中的自动化。1955年，集成有摄像头和自动照明控制的全新摄影显微镜问世。

电子时代

在电子时代，蔡司公司与电子技术企业密切合作，利用不同形式的光源生成图像，对蔡司公司的产品进行多样化产品改进。为保留细胞生物学中的图片，需要配备一台高分辨率显微镜拍摄出清晰细胞结构图片。由Abbe先生发现的入射光分辨率极限和波长之间的关系定理适用于各种辐射形式。因此，使用该电子显微技术后，分辨率极限可以很小、分辨能力会大幅度提高。粗略的说，电子显微镜的分辨率是光学显微镜的100倍，极大增加了所提供信息量深度。

1940年开始，蔡司公司与ARG公司合作进入电子显微镜领域。电子显微镜研发中遇到的挑战是：电子透镜错误比光学玻璃透镜难解决。1949年，蔡司公司推出第一台EM8静态校正透射型电子显微镜TEM，同样奠定蔡司公司研发生产电子显微镜的基石。

1956年后，陆续推出的EM9型电子显微镜是世界上第一台具有自动曝光控制的电磁式透射电子显微镜TEM。

1984年，蔡司公司又在市场上推出EM 902型配用Castaing-Henry过滤器商用电子显微镜。用户利用该种新产品能够得到高分辨率元素分布图片。

本刊提示：多束电子显微镜

运用蔡司公司MultiSEM技术的显微镜工作时，具有多束平行电子射线（绿色：照明光束路径）和探测光束。微调检测路径（红色）为大量二次离子，每条光束都能同步扫描被测样本的同一位置并形成各自的识别图像。发射的电子束呈六边形图案，整个图像由所有图块组成。为快速记录数据采取平行计算机配置，从而提高图像处理速度，图像采集和工作流程控制完全分开。

图2 蔡司公司的Zeiss LSM显微镜——迄今为止市场中技术最领先的共聚焦激光扫描显微镜

1993年，配用静电电磁物镜（Gemini技术）的场发射扫描电子显微镜DSM 982 Gemini投放市场。

蔡司公司2007年推出的Orion显微镜实际上是一个显微系统：被测样本在氦离子的扫描下，而不是在电子扫描下显微观测，因此，具有更高分辨率和更高对比度，这是氦离子显微镜首次在市场上亮相。同年出现的、采用了Crisp系统的TEM透射式电子显微镜是当时全球唯一具有原子水平成像能力的显微系统。

在当代的电子显微镜中，最新型的蔡司MultiSEM 505型电子显微镜（参见本刊提示）是全球第一台具有61条平行射线、4纳米像素点、每秒钟拍摄速度1220百万像素的电子显微镜，这在脑科学家研究神经元网络时十分有用。过去需要几年时间才能完成的大量样本检验分析能够快速完成检测分析。

从2013年起，蔡司公司同样介入到X射线显微技术领域产品研发并提供Versa系列具有亚微米级高分辨率的三维X射线显微镜。

空间立体显微技术

对较大、较厚样本检查分析的要求是光学显微镜领域进一步研发需要解决的重点问题。很长时间以来，在利用光学显微镜对该类样本进行显微检测时需要将其切成薄片。将它们切成薄片时，样本的空间立体结构信息随之丢失。

1982年，蔡司公司推出LSM共聚焦激光扫描显微镜，利用振荡激光束和电子图像处理进行物体扫描，成为市场中金牌产品。共聚焦激光束允许使用很小量的光对聚焦点进行探测，从而生成高对比度光学图片：很窄的光束照射在聚焦层上，可以避免荧光带来的影像模糊问题、不必再将样本切成薄片；另一方面，可以从多个光学视角拆解较厚、较大检测样本。按照此种方法，可以得到被测样本完整的立体信息，利用相应的计算机软件可以得到样本的空间图像。计算机技术和激光技术的发展非常迅速，如今的激光扫描显微镜系统已经具备更多功能，例如，可以完成样本线性扫描或细胞结构的激光扫描。

图3 耶拿蔡司天文馆航拍照片

图4 蔡司细胞发现者Celldiscoverer7型全自动校准显微镜光学设计，确保科研人员在较长时间窗口内的科研实验具有较高质量图像和重复再现性能

突破限制极限

在荧光显微镜中，损失活细胞、组织或生物体毒性、漂白效应以及所得信息是用户亟待解决的一大难题。在生理条件下，研究人员对活体样本观察时间越长，所能获取的活细胞、活组织信息量越多，因此，能够将光负荷减少到最低程度的成像系统市场急需。蔡司公司最新的代表产品Lightheet Z.1型激光片层扫描显微镜将荧光激发和荧光探测分为两个独立的光路，而且，激发光轴和探测光轴之间的夹角垂直，每次只照亮样本很薄的一点区域。该系统能够柔和切割大型样本，在很小的光负荷和较高的时间分辨率情况下完成样本的检测分析，利用该系统可以在30天时间里对活体对象从不同角度进行三维观测。

当然，需要解决的最大问题是分辨率，阿贝分辨率极限原理妨碍进一步提高显微镜分辨率。2006年，Eric Betzing先生和他的同事发明了光激活定位显微技术PALM，利用光对荧光照射各个细胞的开关控制规避阿贝分辨率极限，实现低于磁限200nm约10倍的分辨率。超高分辨率研究工作于2014年和Stefan W. Hell与William E. Moerner先生一起获得诺贝尔化学奖。蔡司公司收购PALM光激活定位显微技术的独家授权，采用该技术的Elyra PS.1超高分辨率显微镜系统实现单分子定位。

所有技术发展从上世纪90年代开始伴随数字化一步步发展起来，在现如今的许多领域中，已完全实现数字化。显微镜也将发展成为具有图像采集、数据处理和数据存储等功能全新的成像工作站。

走向未来

新的电子显微技术和离子显微技术提供了迄今为止从未有过的分辨率和数据质量，从而打开了认识新世纪的大门。再加上纯图像处理技术之外的其它功能，例如，FIB-SEM聚焦离子束——电子束双束显微镜。蔡司公司的Zeiss Crossbeam，能够完成在半导体领域、电子技术领域或者电动汽车制造领域中许多新型表面材料结构和纳米材料结构的检测分析。

如今的显微系统在越来越短的时间里能够产生越来越多的3D和4D数据，在较高程度上平行进行图像采集和处理，具有明显更高的数据处理能力。最新的技术，例如，蔡司公司最新的LSM 800以及LSM 880中使用的Airyscan超分辨率技术具有最高的图像采集和扫描速度，而且，在常规检测分析应用中，显微镜的自动化趋势同样与日俱增——蔡司公司当前最先进的、所谓“Box—显微镜”所代表的技术体现于蔡司公司的细胞发现者Celldiscoverer 7型显微镜中（参见图4）。该系统达到了较高的自动化程度，却也不失传统、活细胞倒置显微研究，所有的科研显微镜图像质量和使用灵活性。

在光学、电子、离子和X射线显微技术中所出现的新技术能够让科研人员越来越多的了解被测样本。填补这些技术之间的漏洞、将这些技术有机的结合在一起是今后几年显微技术领域中需要解决问题。根据结构的相关性、按照结构寻找不同的长度划分——有点像俗话海底捞针所描述的难度，能够明显加快实验分析的显微检验速度或能够将功能相关的特定结构组成新的特殊功能，这些都将会进一步加快科学研究的速度，也肯定会再次突破显微检测分辨率极限。

也许阿贝先生已经考虑到这些问题，因为，他曾说过：“除了名字以外，未来的显微镜会与如今的有所不同。”

本文作者系报刊杂志编辑。