达氏鳇、施氏鲟及其杂交子代胚胎发育期的抗氧化酶活性

张颖 ，徐伟 ，孙大江 ，王斌 ，许式见 ，张镜群 ，胡朝

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.杭州千岛湖鲟龙科技股份有限公司，浙江 杭州 310000；3.西藏自治区农牧科学院，西藏 拉萨 850000；4.四川省都江堰管理局，四川 都江堰 611830）

达氏鳇、施氏鲟及其杂交子代胚胎发育期的抗氧化酶活性

张颖1,3，徐伟1，孙大江1，王斌2，许式见2，张镜群3，胡朝4

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.杭州千岛湖鲟龙科技股份有限公司，浙江 杭州 310000；3.西藏自治区农牧科学院，西藏 拉萨 850000；4.四川省都江堰管理局，四川 都江堰 611830）

利用形态学和生物化学的方法测定达氏鳇Huso dauricus、施氏鲟Acipenser schrenckii及其正反杂交子代的受精率、孵化率、出苗率与胚胎发育期间超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶活性，分析胚胎发育与抗氧化酶含量的关系。结果表明，达氏鳇与施氏鲟为杂交亲和，可获得正常发育的正反交后代，不影响受精率、孵化率及出苗率。不同胚胎发育期鲟的4种主导抗氧化酶类型及变化规律各不相同。在特定发育时期，达氏鳇（♀）与施氏鲟（♂）正交子代（大杂交鲟）的CAT等抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量均接近或高于两亲本中较高的一方；而达氏鳇（♂）与施氏鲟（♀）反交子代（小杂交鲟）介于两亲本之间，特别是SOD、还原型谷胱甘肽（GSH）活性和MDA含量显著低于其父母本。施氏鲟胚胎心脏搏动期SOD的活性最高，达氏鳇胚胎在卵黄栓期SOD的活性最高，而杂交子代的SOD活性均在囊胚期达最大值。综上所述，4种鲟胚胎发育时期内源性抗氧化酶活性的表达差异在一定程度上可解释物种间表型性状的差异。

施氏鲟；达氏鳇；杂交子代；胚胎发育；抗氧化酶

达氏鳇Huso dauricus和施氏鲟Acipenser schrenckii是黑龙江流域特有的重要经济鱼类[1]。达氏鳇是世界上26种鲟科鱼类中，生长速度最快和怀卵量最大的2种鳇属鱼类之一，经济价值高。它性成熟晚，养殖个体大，养殖数量受限[2]。施氏鲟为我国第一个自主开发的养殖鲟，易驯养、性成熟早，但个体生长速度和怀卵量均小于达氏鳇。因此，研究达氏鳇和施氏鲟种属间杂交子代的生物学特性有望获得具有养殖优势的鲟新品种。

鱼类早期发育过程中，胚胎细胞的氧化代谢可产生·OH、O-2·等活性氧分子（Reactive oxygen species,ROS）[3,4]。自然状态下，组织内的自由基清除酶类和抗氧化剂等防御系统可清除活性氧分子，维持体内氧化代谢平衡[4,5]。而在一些损伤环境作用下，胚胎细胞内的氧化代谢物增加，或细胞中抗氧化保护机制不足时活性氧堆积，对胚胎细胞产生毒性，阻滞或延迟胚胎发育[5,6]。研究证实，卵母细胞及胚胎细胞内均含有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GPX）等物质的转录本，这些物质对维持胚胎发育过程中活性氧的动态平衡，保证胚胎正常发育，提高苗种成活率等具有重要的作用[6,7]。对哲罗鲑Hucho taimen胚胎发育过程中内源性抗氧化酶活性的研究表明，SOD等抗氧化酶的活性在胚胎的发生与发育过程中具有特异性变化，表明鱼类胚胎的发生发育与其体内超氧化物自由基的清除有关[7]。本研究采用生物化学方法，研究SOD、GSH和丙二醛（MDA）在达氏鳇、施氏鲟及其正反交子代胚胎中的表达特点，旨在了解以SOD、GSH为代表的抗氧化酶系统在胚胎发育过程中的建立及其对胚胎发育的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

达氏鳇、施氏鲟及其杂交子代各发育时期的胚胎取自杭州千岛湖鲟龙科技股份有限公司孵化车间，均为全人工繁殖受精卵，孵化水温为16～17℃，溶氧≥6.0 mg/L。采用解剖镜观察胚胎发育时期，每2h观察一次，在卵裂期、卵黄栓期、神经胚期、视泡期、心搏期、孵出前期、孵出期等7个发育时期取样（取3对亲本的受精卵，每对亲本10g左右）。用滤纸吸干胚胎水分后，放人5mL的采样管中，于液氮罐中保存备用。

1.2 方法

1.2.1 受精率、孵化率及苗种成活率的计算方法

胚胎发育至高囊胚期时，从孵化瓶中随机取卵100～200粒，放入培养皿中，借助放大镜观察，鉴别受精与否。重复取受精卵三次，取平均值，计算受精率：即正常受精卵数占总采卵数的百分比。

仔鱼孵出期时，发育正常的孵出鱼苗数占总受精卵数的百分比为孵化率。仔鱼发育至平游期时，平游鱼苗数占总受精卵数的百分比为出苗率。采样和计算方法同上。

1.2.2 样品制备

取4种鱼不同发育时期的胚胎样品，加入3倍体积的PBS缓冲液，冰浴匀浆5min，3 000r/min冷冻离心10min，取其上清液用于测定抗氧化酶的活性。

1.2.3 抗氧化酶活性的测定

超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性、还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的含量采用南京建成生物工程研究所试剂盒的操作步骤测定。

1.3 数据处理

用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0软件对试验数据进行统计分析，结果以平均数±标准差（Mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 4种鲟胚胎的受精率、孵化率与苗种成活率

由表1可知，4种鲟的平均受精率、孵化率与出苗率均高于70%，杂交未影响受精率、孵化率与出苗率，虽然杂交鲟与施氏鲟的平均受精率、孵化率与出苗率均高于达氏鳇。

表1 4种鲟受精率、孵化率与出苗率Tab.1 Fertilization rate,and hatching rate of fertilized eggs and mortality of postlarvae in four sturgeons

2.2 4种鲟不同时期胚胎的SOD和CAT活性

4种鲟胚胎SOD活性随胚胎发育进程的变化规律见图1。如图1所示，施氏鲟胚胎SOD活性随发育的变动范围为55.84～256.03 U/g prot，最大值出现在心脏搏动期。而达氏鳇胚胎的SOD活性值随发育时间的变动范围则为61.31～171.84 U/g prot，最大值出现在卵黄栓期。与施氏鲟和达氏鳇胚胎SOD活性的变动范围不同，大杂交鲟SOD活性在囊胚期、神经胚期、初孵仔鱼期较高，分别为136.25 U/g prot、113.59 U/gprot和 106.44 U/gprot，其他时期均较低。小杂交鲟SOD活性的变动范围为60.36～142.34 U/gprot，囊胚期活性最高。

如图2所示，4种鲟胚胎发育期CAT活性的变化规律大致相同。施氏鲟与达氏鳇卵黄栓期的CAT活性最高，分别为30.22 U/g prot和33.36 U/g prot。而大杂交鲟胚胎的CAT活性在囊胚期达最高，显著高于施氏鲟、达氏鳇和小杂交鲟的同期胚胎（P＜0.05）。与大杂交鲟的胚胎不同，小杂交鲟胚胎的CAT活性在卵黄栓期达最高，为21.52 U/gprot。

图1 4种鲟不同胚胎发育时期SOD活性的变化Fig.1 Changes in SOD activity of four sturgeons

图2 4种鲟不同胚胎发育时期CAT活性的变化Fig.2 Changes in CAT acitivity of four sturgeons

2.3 4种鲟不同胚胎期GSH含量的变化规律

由图3可知，4种鲟胚胎的GSH含量随着胚胎发育时间的增加而表现出不同的变化规律。施氏鲟胚胎的GSH含量在囊胚期最高，为778.78 U/gprot，而卵黄栓期和心脏搏动期的活性则分别为324.55 U/gprot和451.21 U/gprot。与施氏鲟胚胎相同，达氏鳇胚胎的GSH含量最高值也出现在囊胚期，最低值则出现在孵化晚期，为16.43 U/g prot。大杂交鲟胚胎的GSH含量较低，孵化晚期最高，为226.97 U/g prot。小杂交鲟胚胎的GSH含量则显著低于其他3种鲟胚胎。

图3 4种鲟不同胚胎发育时期GSH活性的变化Fig.3 Changes in GSH content of four sturgeons

2.4 4种鲟不同时期胚胎MDA含量的变化

图4 4种鲟不同胚胎发育时期MDA含量的变化Fig.4 Changes in MDA content of four sturgeons

如图4所示，4种鲟不同时期胚胎MDA含量的变化规律相同，均呈先升高后降低的变化规律。整个胚胎发育过程中，施氏鲟胚胎MDA含量呈升高后降低的趋势，卵黄栓期含量最高，为48.26 U/mg prot，孵化晚期最低，为5.45 U/mg prot。达氏鳇胚胎的MDA含量也呈升高后降低的变化趋势，卵黄栓期的MDA含量最高，为23.37 U/mgprot。大杂交鲟胚胎MDA含量在神经胚期最高，为24.39 U/mg prot，而小杂交鲟胚胎的MDA含量较低，孵化晚期的含量最低，为4.59 U/mgprot。

3 讨论

3.1 鲟杂交亲和性的研究

鲟染色体组型复杂，微型染色体数众多[11]。长期以来，人们一直试图通过种间或属间杂交改良鲟的品质，实现鲟种质有益基因的渗透。1953年Nikoljukin和Timofeeva通过杂交组合，获得多个杂交鲟新品种，筛选出生长迅速、可育、性成熟早的小鳇鲟（欧鳇H.huso♀×小体鲟Acipenser ruthenus♂），其能在淡水和咸淡水中生活，是目前较为成功的杂交鲟，表明鲟科鱼类属间杂交亲和[12]。

近些年，随着世界鲟养殖热潮的兴起，鲟杂交组合研究也方兴未艾[13-15]。Hassanzadeh Saber（2015）等[14]进行了裸腹鲟（A.nudiventris Lovetsky,1828）和西伯利亚鲟（A.baerii,Brandt,1869）种间杂交；Schrey等2011年进行密苏里铲鲟Scaphirhynchus albus和铲鲟Scaphirhynchus platorynchus杂交的组合，分析其杂交种的形态和遗传特征[13,14]。Vasil’eva和Grunina（2011）[15]研究了西伯利亚鲟和达氏鳇属间杂交的形态学。我国对杂交鲟的研究起步较晚，先后进行了施氏鲟×达氏鳇、施氏鲟×西伯利亚鲟、施氏鲟×俄罗斯鲟、小体鲟×施氏鲟、俄罗斯鲟×西伯利亚鲟等多个杂交组合。其中，小体鲟♂×施氏鲟♀种间杂种的胚胎发育过程中，受精率低于10%，胚胎发育至孵化早期出现异常，大量死亡。大量的研究结果表明，鲟的种间和种属间杂交表现出一定的亲和性，但有些种间杂交则表现出杂交不亲和或弱亲和[16-18]。

3.2 鲟胚胎发育过程中抗氧化酶活性的变化规律

研究证实，鱼类的受精卵中储存相关的抗氧化酶或mRNA，对胚胎发育的启动具有重要作用，为胚胎早期发育中细胞的快速增长及迁移提供保障[19-21]。研究发现，普安银鲫胚胎中含有母源性酶类，对胚胎发育的启动以及早期卵黄物质的利用，一直发挥着重要的抗氧化作用[19]。对施氏鲟胚胎发育过程中抗氧化酶的研究也表明，鲟科鱼类也存在着母源性抗氧化酶类，对胚胎发育具有重要的作用[5]。本研究发现，4种鲟受精卵和卵裂期开始时，SOD等酶均具有活性，表明了受精卵在发育早期具有一定的SOD等抗氧化酶活性，但均为受精卵中的母源性酶类，并非合子基因表达的产物。

活性氧是氧代谢产物和一些反应的含氧产物，生成量约占组织总耗氧量的l%～2%，可诱导生物大分子发生氧化反应而改变其结构及构象，发挥如信号传递等重要的调控功能[19-21]。不同发育阶段的胚胎代谢特点及所需营养不同，活性氧分子（ROS）的产生类型和生成量不同，起主导作用的抗氧化酶的类型也不同[22,23]。本研究中，SOD和CAT在不同胚胎期活性不同，大杂交鲟SOD酶活性在囊胚期起关键性作用，促进囊胚腔的形成，这一时期可能是卵裂过程中产生的自由基使母源性SOD活性增加[24]。施氏鲟SOD活性在心搏期最高，CAT活性也较大。该期为心脏形成的关键期，表明SOD和CAT在施氏鲟心脏搏动发育中发挥着重要的抗氧化作用，这可能与合子基因的表达有关[24]。与施氏鲟不同，达氏鳇的SOD和CAT活性最高值出现在卵黄栓期，表明其卵黄栓发育过程中受到氧化损伤。达氏鳇胚胎通过增加SOD和CAT活性有效地降低损伤，这一结果与Rudneva的研究结论一致[25]。

GSH含量是衡量鱼体抗氧化能力的重要因子之一[15]。本研究中，大杂交鲟胚胎出膜期的GSH含量最高，表明其在出膜期发挥了重要的抗氧化作用，促进了出膜，与哲罗鱼胚胎发育的研究结果一致[15]。整个胚胎发育过程中，小杂交鲟GSH含量较低，表明SOD和CAT在小杂交鲟胚胎发育过程中起主要抗氧化作用。研究证实，MDA可间接地反映鱼类组织细胞受自由基攻击的程度[22]。本研究中，施氏鲟胚胎的MDA含量在囊胚期和卵黄栓期出现两个峰值，与其胚胎死亡率较高的现象相一致，表明施氏鲟胚胎在囊胚期和卵黄栓期易受到氧化损伤[5]。达氏鳇胚胎的在卵黄栓期MDA含量最高，大杂交鲟则出现在神经胚期，而整个胚胎发育时期小杂交鲟胚胎的MDA含量变化不显著，表明4种鲟胚胎发育期的抗氧化机制不同。

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Antioxidant Enzyme Activities During Embryonic Development of Huso dauricus,Acipenser schrenckii and their Hybrids

ZHANG Ying1,2,XU Wei1,SUN Da-jiang1,WANG Bin2，XU Shi-jian2,ZHANG Jing-qun3,HU Cao4
（1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China;2.College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;3.Tibet Autonomous Region Academy of Agriculture and Animal Husbandry,Lhasa 850000,China;4.Dujiangyan Authority of Sichuan Province,Dujiangyan 611830,China）

Fertilization rate and hatching rate of fertilized eggs and mortality of post-larvae were monitored and activities of antioxidant enzymes including acid phosphatase （ACP）,alkaline phosphatase （AKP）,superoxide dismutase （SOD）and catalase（CAT）were determined during embryonic development in Acipenser schrenckii,Huso dauricus and their hybrids by biochemical methods to evaluate the mechanism of heterosis.It was found that hybridization between Acipenser schrenckii and Huso dauricus showed high cross-compatibility with natural crossing progenies,indicating that the fertilization rate,hatchability and mortality of post-larvae were not affected by hybridization.Antioxidant enzyme activities were shown to be different patterns during embryonic development in Acipenser schrenckii and Huso dauricus and their hybrids.There were similar or higher antioxidant enzyme activities in the hybrid between Huso dauricus（♀）×Acipenser schrenkii（♂）than those in their parents with higher antioxidant enzyme activity in some particular embryonic development stage.The hybrid between Acipenser schrenkii（♀）×Huso dauricus（♂）had significant lower SOD activity and glutathione（GSH）and malondialdehyde（MDA）contents than their parents did（P ＜ 0.05）.The maximal SOD ac-tivity was observed at heart beating phase in Acipenser schrenkii and at yolk plug phase in Huso dauricus.The maximal SOD activity,however,was found at blastula phase in the hybrids.The findings indicate that the heterosis between Huso dauricus and Acipenser schrenkii can partially be explained by the differences in antioxidant enzyme activities among the sturgeons.

Acipenser schrenkii;Huso dauricus;hybrid;embryonic development;antioxidant enzyme

S965.215

A

1005-3832（2017）06-0019-05

2017-03-21

公益性行业（农业）科研专项（201203086）；杭州市钱江特聘专家（2016）；黑龙江省冷水性鱼类种质与增养殖重点实验室项目.

张颖（1977-），女，博士，副研究员，从事鱼类繁殖生理研究．E-mail:juletzhang@hotmail.com

孙大江，男，研究员．E-mail:13845059350@163.oom