果胶糖基化改性乳清蛋白工艺优化

蔡 丹，原秀玲，王玉华，修 琳，刘景圣

（吉林农业大学食品科学与工程学院，小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林长春 130118）

果胶糖基化改性乳清蛋白工艺优化

蔡 丹，原秀玲，王玉华，修 琳，*刘景圣

（吉林农业大学食品科学与工程学院，小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林长春 130118）

以乳清蛋白为原料，与果胶通过美拉德反应进行干法糖基化改性，研究果胶与乳清蛋白配比、糖基化反应时间和pH值对乳清蛋白膜成膜性的影响。在单因素试验基础上，通过正交试验确定最佳糖基化改性条件。试验结果表明，当果胶与乳清蛋白质量配比为3∶1，反应时间为76 h，乳化体系的pH值为8.4时，乳清蛋白-果胶产物膜的拉伸强度（TS）为1 247.13±0.29 g，断条伸长率为31.52%，乳清蛋白-果胶糖基化产物接枝度为49.523%。

乳清蛋白；果胶；糖基化；拉伸强度

乳清蛋白是干酪生产副产物——乳清经过特定工艺而加工得到的一类蛋白质，主要含有α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白、乳过氧化物酶和许多生物活性因子等[1]，其中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分别占乳清蛋白总量的20%和60%[2]。乳清蛋白作为优质的蛋白质补充剂之一，富含多种人体必需氨基酸，具有营养价值高、易消化吸收、高生物效价等特点[3-4]，因而又被称为“蛋白之王”。随着对乳清蛋白研究的不断深入，其丰富的蛋白质营养价值及良好的功能特性被不断发掘，目前乳清蛋白已成为保健食品和营养制品生产的重要原料和添加成分，广泛应用于食品生产中[5-7]。尤其是乳清蛋白可食用膜，已成为国内外学者的研究热点[8-9]。尽管如此，由于乳清蛋白本身功能特性不够完善，具有致敏性、β-乳球蛋白的结构等缺陷，这些问题严重限制了其应用范围。因此，近年来国内外研究学者致力于乳清蛋白的改性研究，通过采用物理、化学和生物法对乳清蛋白进行处理[10]，改变乳清蛋白的分子量大小、氨基酸的组成和空间排列构象、电荷分布情况、疏水基团的分布等，从而改善乳清蛋白的功能特性[11]，提高乳清蛋白的利用率和应用范围。

本研究以乳清蛋白（WPC） 和果胶（P） 为原料，采用干法糖基化改性的方法，使果胶与乳清蛋白发生美拉德反应，改变乳清蛋白的交联情况，使蛋白膜的结构紧密，以成膜性为考核指标，确定糖基化改性乳清蛋白最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浓缩乳清蛋白（质量分数79%），希尔玛乳酪公司提供；果胶，SIGMA-ALDRICH，上海贸易有限公司提供。

1.2 主要仪器与设备

TA-XTplus型食品物性测试仪，英国Stable Micro Systems公司产品；K1100型全自动凯氏定氮仪，济南海能仪器有限公司产品；0.2型真空冷冻干燥机，沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司产品；PHS-3C型pH计，上海精密科学仪器有限公司产品；HPX-9162 MBE型数显电热恒温恒湿培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；CP214型电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 乳清蛋白-果胶干法糖基化方法

首先，将浓缩乳清蛋白溶于去离子水中，用磁力搅拌器迅速搅拌，边搅拌边缓慢加入适量的果胶，待充分溶解后，调节pH值，将溶解好的乳清蛋白-果胶混合物进行真空冷冻干燥，得到乳清蛋白-果胶混合物固体样品。将该样品放入恒湿培养器内，在一定温度下，每隔一段时间进行取样，得到乳清蛋白-果胶糖基化产物。

1.3.2 成膜方法

准确称取乳清蛋白-果胶糖基化产物配制一定浓度溶液，加入适量的甘油（g/g糖基化产物），脱气后放入干燥箱中干燥，揭膜后放在恒温恒湿培养箱中（温度23℃，相对湿度50%） 平衡48 h，之后对膜的机械性能即拉伸强度（Tensile strength，TS）和断裂伸长率（Elongation at break，E）进行测定。

1.3.3 乳清蛋白-果胶干法糖基化条件优化

（1）单因素试验设计。将果胶与乳清蛋白按质量比 （底物配比） 1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1混合，调节pH值为7.0，7.2，7.4，7.6，7.8，8.0，8.2，8.4，8.6，8.8，9.0，冷冻干燥后放置于相对湿度为79%（饱和KBr溶液） 的条件下，反应36，48，60，72，84 h，制备乳清蛋白-果胶糖基化产物，并制备成膜溶液，测定膜的机械性能。

（2）响应面试验设计。根据单因素的分析结果，各因素对乳清蛋白-多糖糖基化产物膜的TS值和E值的影响是一致的。采用Design Expert（8.0.6） 中Box-Behnken试验设计方法，建立拉伸强度（TS） 与乳清蛋白-果胶糖基化反应时间、pH值、底物配比的回归方程，确定乳清蛋白-果胶糖基化产物膜最优制备工艺条件。相同条件下以乳清蛋白独自成膜为对照组。

1.4 膜机械性能的测定

将在相对湿度50%条件下平衡48 h的膜裁成1 cm×5 cm的条状后用物性仪测定，条件设定为初始夹距10 mm，拉伸距离45 mm，以3.3 mm/s的速度匀速拉伸，测定后分析膜的拉伸强度和断裂伸长率。拉伸强度为膜被拉伸断裂时所受到的拉力最大值，断裂伸长率为膜被拉伸后长度的增量占原长度的百分比。

2 结果与分析

2.1 乳清蛋白-果胶干法糖基化条件优化单因素试验结果

2.1.1 不同反应时间对乳清蛋白-果胶膜机械性能的影响

确定反应温度为60℃，pH值为8，底物配比为3∶1，相对湿度为79%，改变反应时间分别为36，48，60，72，84 h制备乳清蛋白-果胶膜，测定其拉伸强度（TS） 和断条伸长率（E）。

不同反应时间对WPC-P膜TS和E的影响见图1。

图1 不同反应时间对WPC-P膜TS和E的影响

由图1可知，反应时间会显著影响（p＜0.05）乳清蛋白-果胶膜的拉伸强度和断条伸长率，且在试验设计的时间范围内，拉伸强度和断条伸长率的变化呈现一致性。在一定时间范围内，果胶和乳清蛋白游离氨基的共价结合程度、糖基化程度与反应时间呈正相关，导致成膜过程中糖蛋白分子交联形成的空间网络结构逐渐致密；但随着反应时间的进一步延长，糖蛋白分子的致密空间结构被重新打破，从而引起乳清蛋白-果胶膜的机械性能降低。因而，随着加热时间的延长，乳清蛋白-果胶膜的机械性能呈先高后低的趋势。在反应时间为72 h时，膜的机械性能最优。

2.1.2 不同pH值对乳清蛋白-果胶膜机械性能的影响

确定反应温度为60℃，反应时间为72 h，底物配比为3∶1，相对湿度79%，改变反应体系的pH值分别为 7.0，7.2，7.4，7.6，7.8，8.0，8.2，8.4，8.6，8.8，9.0，制备乳清蛋白-果胶膜，测定其拉伸强度（TS） 和断条伸长率（E）。

不同pH值对WPC-P膜TS和E的影响见图2。

图2 不同pH值对WPC-P膜TS和E的影响

由图2可知，反应体系的pH值会显著影响（p＜0.05） 乳清蛋白-果胶膜的机械性能。当反应体系pH值为8.4时，乳清蛋白-果胶膜的拉伸强度和断条伸长率达到最大值，之后随着pH值的不断升高膜的机械性能呈现逐渐减小趋势。有文献[12]表明，自由氨基在酸碱条件下的反应活性不同，在酸性条件下反应活性低，在碱性条件下反应活性较高。本质上，糖基化反应属于碱催化反应，因此碱性条件下更有利于糖蛋白的结合，但是随着糖基化反应程度的进一步加大会引起乳清蛋白-果胶膜空间网络结构等疏松，从而使膜的机械性能降低。

2.1.3 不同底物配比对乳清蛋白-果胶膜机械性能的影响

在温度为60℃，相对湿度为79%，反应时间为72 h，pH值为8.4的条件下，改变底物配比（果胶/乳清蛋白） 分别为1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1制备WPC-P膜，测定其TS和E。

不同底物配比对WPC-P膜TS和E的影响见图3。

图3 不同底物配比对WPC-P膜TS和E的影响

由图2可知，底物配比会显著影响（p＜0.05） 乳清蛋白-果胶膜的机械性能。在试验设计的底物配比范围内，随着果胶添加量的增加，乳清蛋白-果胶膜的机械强度呈先升高后降低的趋势，当底物配比为3∶1时，乳清蛋白-果胶膜的机械性能最高。有研究表明[13]，糖添加比例的升高增加了反应体系中自由氨基与糖分子中羰基之间碰撞和接触机率，促进了糖蛋白分子直接的交联，从而提高了膜的机械强度。由于果胶本身溶解度和流动特性的影响，当反应体系中继续增加果胶的添加比例时，反应体系的黏度增大，分子流动性变差，会影响反应的进行，同时过多的糖蛋白分子交联会打乱原来有序的空间网络结构，从而导致膜的机械强度降低。这与华静娴等人[14]关于大米蛋白美拉德反应的研究结果一致。

2.2 乳清蛋白-果胶干法糖基化条件响应面试验设计结果

2.2.1 响应面试验设计与结果

在单因素试验基础上，选取反应时间、反应体系的pH值和底物配比3个因素进行Box-Behnken试验设计。

响应面分析因素与水平设计见表1，Box-Behnken分析方案及试验结果见表2，回归方程的方差分析见表3。

表1 响应面分析因素与水平设计

表2 Box-Behnken分析方案及试验结果

由表2可知，响应面试验设计17个试验。通过用对试验结果进行的回归分析及方差分析，得到的回归方程为：

Y=1 246.52+6.12A+3.23B+2.89C+1.55AB-0.54AC-0.76BC-9.96A2-10.55B2-3.70C2.

由表3可知，回归方程因变量和自变量之间存在显著的线性关系（R2=0.993 5），方程p＜0.01，表明此回归方程极其显著；其中失拟项p=0.563 8＞0.05，说明此回归方程对试验的拟合度较好，证明了试验设计与方法的可靠性。

2.2.2 各因素间相互作用

表3 回归方程的方差分析

图4 两因素交互作用影响膜拉伸强度值的响应曲面图及其等高线

两因素交互作用影响膜拉伸强度值的响应曲面图及其等高线见图4。

由图4可知，反应时间、反应体系的pH值、底物配比都极显著地影响了乳清蛋白-果胶膜的拉伸强度值。通过对回归方程求极值点得：A=75.73，B=8.43，C=3.35，Y=1 248.24，即得出的最优工艺条件是反应时间75.73 h，乳化体系的pH值8.43，底物配比3.35∶1，在此条件下WPC-P膜拉伸强度值理论上能达到1 248.24 g。为了进一步验证响应面优化设计结果的准确性，对上述结果进行近似验证试验，按照实际操作性将反应时间设定为76 h，反应体系的pH值设定为8.4，底物配比设定为3.0∶1，在此条件下进行3次WPC-P糖基化反应，乳清蛋白-果胶膜的平均TS值为1 247.13±0.29 g，与理论预测值基本相符，证明Box-Behnken模型适用于该试验设计，在此条件下E值为31.52%，糖基化产物接枝度为49.523%。在响应面优化确定的条件下干法培养乳清蛋白，得到乳清蛋白膜的平均TS值为353.61±0.51 g。可以看出糖基化改性的乳清蛋白膜的TS值比对照乳清蛋白膜提高了2.5倍。

3 结论

本试验在单因素试验基础上，通过正交试验确定乳清蛋白-果胶干法糖基化的改性工艺，当果胶与乳清蛋白质量配比3∶1，反应时间76 h，反应体系的pH值8.4时，乳清蛋白-果胶产物膜的拉伸强度最高，比未改性的乳清蛋白膜提高了2.5倍。

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[14]华静娴，陈正行，钟芳.大米蛋白-葡聚糖接枝耦联反应的研究 [J].食品科学，2008，29（12）：45-50.◇

Optimization by Glycosylation Modifications of Whey Protein-pectin

CAI Dan，YUAN Xiuling，WANG Yuhua，XIU Lin，*LIU Jingsheng
（National Engineering Laboratory for Wheat and Corn Deep Processing，College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun，Jinlin 130118，China）

In order to improve the mechanical properties of whey protein concentrate（WPC） edible film，whey protein（WPC） -pectin（P） conjugate film was prepared by glycosylation modifications under dry-heating condition.The effects of Pectin/WPC ratio,reaction time and pH value on the tensile strength and elongation at break of WPC-SA conjugate film were analyzed.A single-factor and orthogonal test were employed to optimize the reaction conditions.The optimum reaction conditions were determined as Pectin/WPC radio of 3∶1，reaction time 76 h，pH value 8.4.Under these conditions,the experimental value of tensile strength （TS） of WPC-P conjugate film was 1 247.13±0.29 g and closely agreed with the theoretical value，the elongation at break（E） of WPC-P conjugate film was 31.52%，the graft degree of glycosylation products was 49.523%.

whey protein；pectin；glycosylation；tensile strength

TS201.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.12.037

1671-9646（2017） 12b-0035-04

2017-10-28

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（2015187）；国家“十二五”科技支撑计划项目（2013BAD18B07）。

蔡 丹（1980— ），女，博士，副教授，研究方向为食品生物化学工程与功能性食品。

*通讯作者：刘景圣（1964— ），男，博士，教授，研究方向为粮食深加工与功能性食品。