茜草，茜草炭对血瘀大鼠肺组织中SOD、MDA、NO、NOS的影响

王侃

摘要：目的通过SOD、MDA、NO、NOS指标评价茜草、茜草炭对急性血瘀大鼠肺组织的影响。方法以SD大鼠为研究对象，测定其SOD、MDA、NO、NOS四项指标观察茜草生、茜草炭对血瘀大鼠肺组织的影响。结果模型组比空白组MDA上升，SOD下降，有统计学意义。茜草组与模型组比较MDA下降，SOD活性上升。茜草炭与模型组比较MDA上升，SOD无统计学意义。模型组与空白组比较NO、TNOS、cNOS含量均减少，且有统计学意义。茜草组与模型组比较NO、TNOS、cNOS含量均增加。茜草炭组NO含量有一定的减少，TNOS、iNOS含量有一定程度的增加，但其程度不如生品。

关键词：茜草；茜草炭；肺组织

茜草系茜草科植物茜草（Rubiacordifolia L.）的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》[1]。其味苦，性寒，无毒。主寒湿风，痹，黄疸，补中，止血，内崩，下血，膀胱不足，踒跌，蛊毒。久服益精气轻身。可以绛染。一名地血，一名茹藘，一名茅蒐，一名蒨。生乔山川古。二月、三月采根，曝干。畏鼠姑[2]。

现临床茜草常用于治疗慢性肺出血，咳嗽出血。急性血瘀模型大鼠肺部出血症状明显[3]，所以本实验复制大鼠急性血瘀模型。用以评价茜草生品、炭品对急性血瘀大鼠凝血机制的异同。

由前期肺组织显微观察可知急性血瘀的模型大鼠肺组织损伤严重，给药组对肺组织修复的侧重点不同，炭品主要减轻出血症状，生品主要修复肺组织结构，减少炎症细胞。为了探讨急性血瘀大鼠是否是由于氧化-抗氧化系统平衡失调引起的肺部损伤及进一步探讨茜草、茜草炭在治疗血瘀症时的差异。设计实验从大鼠肺组织的MDA/SOD水平及NO，NOS水平来探讨茜草的生熟异用。

1 材料

1.1动物

SD大鼠50只，雌性，体重200-240g，购自浙江省实验动物中心，许可证号：SCXK（浙）2008-0033。

1.2 药品与试剂

SOD、MDA、NO、NOS试剂盒（南京建成生物工程研究所），枸橼酸钠（天津市科密欧化学试剂开发中心，批号：20051005），盐酸肾上腺素注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批号：1009041）。云南白药（云南白药集团股份有限公司生产，批号：20090116），药材均购自于安徽铜陵药材有限公司。

1.3 仪器

Anke-LXJ-11B 离心机（上海安寿科学仪器厂）、酶标仪（美国Bio-Tek公司）

1.4供试液的制备

空白对照组0.5%CMC-Na溶液。

阳性对照组（云南白药组）因云南白药临床用量为2g，实验动物按临床用量20倍给药，即0.227g/kg。实验前用0.5%羧甲基纤维素钠溶液将云南白药混匀并稀释至所需浓度。

茜草生品组购于安徽铜陵（批号100326），经南京中医药大学吴启南教授鉴定为茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根及根茎。参照其临床用量10g，实验动物按临床用量20倍给药，即5g生药/kg。取适量茜草生品，适当粉碎后过200目筛。取适量粉末，加入0.5%CMC-Na研磨均匀，并配制成所需浓度。

茜草炭则是将所购生品按2010年版《中国药典》一部茜草炭炮制方法炒至表面焦褐色，内部焦黄色的自制炭品。参照其临床用量10g，实验动物按临床用量20倍给药，即5g生药/kg。取适量茜草生品，适当粉碎后过200目筛。取适量粉末，加入0.5%CMC-Na 研磨均匀，并配制成所需浓度。

1.5数据统计和处理方法

采用SPSS16.0统计软件进行检验，实验数据以x±s表示。方差齐时选择t检验结果，方差不齐时选择校正t检验结果，以此比较模型组与各给药组之间的显著性差异。

2实验方法

2.1样品制备

取大鼠50只，雌性，体重220（±20）g，随机分为7组，分别为空白组，模型组，云南白药组0.27g/kg、茜草生品组5g/kg、茜草炭品组5g/kg，每组10只。正常组与模型组ig0.5%羧甲基纤维素钠溶液2mL·100g-1，其余组ig等体积的相应药物，每日1次，连续7d。第6d给药后禁食，除空白组外，其余组背部sc盐酸肾上腺素1mL·kg-1，共2次，中间间隔4h，并在第1次sc4h后将大鼠浸入0～2℃冰水冰浴5min，复制急性血瘀大鼠模型[1]，正常组sc等体积的生理盐水。将其处死，进行解剖取下肺，按照重量/体积比例加入9倍的0.9%生理盐水制成肺组织匀浆，低温低速离心10 min（3000r/min），取上清液，-20℃保存待测生化指标。

2.2肺组织SOD、MDA、NO、NOS合酶的含量测定[4]

2.2.1组织蛋白含量

测定原理：蛋白质具有-NH3+基团，当考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准或样品中，考马斯亮兰上的阴离子与蛋白-NH3+结合，用酶标仪测定其含量。

2.2.2 SOD活血测定：

测试原理：通过黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶的反應产生超氧化阴离子自由基（O2-），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现出紫红色，通过酶标仪测其吸光度。通过公式计算出SOD活性。

试剂配制及操作步骤：所有试剂均按照试剂盒说明书配制，方法按照说明书上都提供组织样本的测定方法测定。测定结果见表1

计算公式：

2.2.3 MDA活性测定

测试原理：过氧化脂降解产物中的MDA可以硫代巴比妥酸缩合，形成红色的产物，经酶标仪在532nm下测定。通过公式计算出MDA活性。

试剂配制及操作步骤：所有试剂均按照试剂盒说明书配制，方法按照说明书上都提供组织样本的测定方法测定。测定结果见表1。endprint

计算公式：

2.2.4 NO含量的测定

测试原理：NO化学性质活泼，在体内迅速代谢转变为NO2-和NO3-，而NO2-又进一步转化为NO3-。利用硝酸还原酶特异性的将NO3-还原成NO2-，根据显色原理通过酶标仪测定吸光度以测定浓度。

试剂配制及操作步骤：所有试剂均按照试剂盒说明书配制，方法按照说明书上都提供组织样本的测定方法测定。测定结果见表2。

计算公式：

2.2.5 NOS活性测定

测定原理：NOS可以催化L-Arg和分子氧反应生成NO，NO与亲和性物质反应生成在530nm下显色的化合物，用酶标仪测定NOS活力。

试剂配制及操作步骤：所有试剂均按照试剂盒说明书配制，方法按照说明书上都提供组织样本的测定方法测定。测定结果见表2。

计算公式：

2.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行检验，实验数据以x±s表示。方差齐时选择t检验结果，方差不齐时选择校正t检验结果，以此比较模型组与各给药组之间的显著性差异。

3实验结果

3.1 大鼠肺组织中MDA、SOD的变化。

结果显示模型组比空白组MDA上升，SOD下降，有统计学意义。茜草组与模型组比较MDA下降，SOD活性上升。茜草炭与模型组比较MDA上升，SOD无统计学意义。

注：与模型组比较，*p<0.05

3.2 大鼠肺组织中NOS、NO的变化

模型组与空白组比较NO、TNOS、cNOS含量均减少，且有统计学意义。茜草组与模型组比较NO、TNOS、cNOS含量均增加。茜草炭组NO含量有一定的减少，TNOS、iNOS含量有一定程度的增加，但其程度不如生品。结果见表2。

注：与模型组比较，*p<0.05，

4讨论

丙二醛（MDA）是机体通过酶系统与非酶系统产生的自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸所产生的一种脂质过氧化物。SOD是一种体内能够清除超氧阴离子自由基（O2-·）保护机体免受氧化损伤的一种酶。一氧化氮是（NO）在血液系统起着信使因子的作用。NO能够维持血管张力的恒定与调节血压稳定作用。当血液系统紊乱时NO的含量将会异常。体内NOS有结构型NOS（cNOS）和诱导型NOS（iNOS）2种。cNOS先天性存在，生成NO数量较少，产生迅速。iNOS在生理情况下基因不表达，当受到某些细胞因子、病原微生物或肿瘤细胞刺激后，即被激活，大量产生iNOS，且持续时间长。其中cNOS催化的NO肺组织粘膜有保护作用，而iNOS催化的NO机体有杀伤毒性及促炎作用[5]。

急性血瘀导致了肺组织发生了病变，模型组中SOD活性下降，MDA含量增加。说明氧自由基通过脂质过氧化反应参与了急性血瘀的发病过程。而茜草组急性血瘀大鼠肺组织中MDA含量降低，SOD活性升高，说明其能够通过清除氧自由基，减少过氧化脂质生成。从而治疗急性血瘀引起的肺组织损伤。模型组中NO含量降低，可能是由于组织中含氧水平较高，NO可和O2-反应生成生成ONOO-，对机体有毒害作用。而茜草组NO含量增加对血管起到扩张保护作用，从而化瘀。而由于茜草炭的肺组织中SOD处于较低水平，而MDA含量增加，推测此时机体类的氧含量仍处于较高水平，使得茜草炭品组NO含量降低。模型组与空白组相比诱导型iNOS含量增加，iNOS含量的增加可能是导致肺组织炎症细胞浸润的原因之一。茜草给药组结构型cNOS含量增加，对肺组织粘膜有保护作用。

所以笔者认为茜草生品、炭品对机体的作用的机制有很大差异，并不能一味的认为当出血增多时茜草炭品便可替代生品应用于临床。

参考文献

[1]叶定江，原思通.中药炮制学辞典[M].上海：上海科学技术出版社，2005.283-284

[2]宋·卢多逊.李昉等.开宝本草[M].安徽：安徽科学技术出版社，1998.178

[3]孔祥鵬.陈佩东.丁安伟.蒲黄与蒲黄炭对血瘀大鼠血液流变性及凝血时间的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（6）：143-145

[4]胡志伟.陈漪.张凯伦.曲格列酮对凝血酶诱导的内皮细胞诱导型一氧化氮合酶和吸附分子表达的抑制作用[J].中国循环杂志，2007，22（2）：142-145

[5]刘彤.吴亚光.邵军.一氧化氮和内皮素在肝脏在灌注损伤和缺血预处理中的作用研究[J].医学信息手术学分册，2007，20（1）：53-55endprint