“一测多评”法测定茜草中3种有效成分百分含量

王　锐，曹　赢，王知斌

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)



“一测多评”法测定茜草中3种有效成分百分含量

王锐，曹赢，王知斌

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)

采用“一测多评”法测定茜草中3种成分的百分含量.流动相为乙腈-0.2%磷酸水(43∶57)流速1.0 mL/min，检测波长为250 nm.以大叶茜草素为内标物，测定与茜草素、羟基茜草素的相对较正因子.计算茜草中3种成分的含量，并比较“一测多评”法的计算值与外标法实测值的相似度. “一测多评”法和外标法测得的茜草素、羟基茜草素的含量相似度均为0.99，“一测多评”法和外标法的实测值间无显著性差异.建立的“一测多评”法适用于茜草中3种有效成分的含量测定，相对校正因子可信.

“一测多评”法；茜草；大叶茜草素；羟基茜草素；茜草素

茜草为茜草科植物(Rubia cordifolia L.)的干燥根及根茎，其具有凉血、止血、化瘀、通经的功效，主治吐血、衄血、外伤出血、跌打肿痛、风湿痹痛、经闭瘀阻等症[1].茜草中主要含有蒽醌、萘醌及其苷类、环己肽类、萜类等[2].茜草成分复杂、多样并且作用机制模糊，因此应进行多成分的百分含量测定用于茜草药材的质量控制.由于中药化学对照品分离难度大或供应价格高等元素，限制了多指标成分进行质量控制的外标法的实际应用.“一测多评”法是通过测定中药中一种代表性成分的百分含量，依据相对较正因子推算该中药中多种待测成分的百分含量，并控制计算值与实测值符合定量方法学要求的一种多指标同步质量控制方法[3-4].本研究采用“一测多评”法，以大叶茜草素为内标物，测定10批茜草药材中茜草素、羟基茜草素2种成分的百分含量，并与外标法实测值进行比较，为茜草的百分含量测定提供一种可供选择的新方法，为茜草的研究提供数据支持.

1　材 料

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括1260系列四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器、化学工作站；Milli-Q超纯水系统(法国Millipore公司)；FA2004分析电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DFT-200告诉中药粉碎机(浙江温岭市大德中药机械有限公司).

茜草，共10批，经黑龙江中医药大学闫广利副教授鉴定为茜草科植物(Rubia cordifolia L.)，购于市售药店；大叶茜草素、羟基茜草素及茜草素均为成都普菲德生物技术有限公司提供；甲醇、乙腈均为色谱纯；水为超纯水，自制；盐酸、三乙胺均为分析纯.

2　方法与结果

2.1色谱条件及适用性

Waters WAT054270-C8柱(250mm×4.6mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.2%磷酸水(43∶57)流速1.0 mL/min；检测波长为250 nm，柱温30 ℃；进样量为10 μL.在上述色谱条件下，各组分分离度良好，峰形尖锐，基线平稳，供试品色谱与对照品色谱在相同时间上有对应的吸收峰.色谱图见图1.

2.2对照品溶液的制备

精密称取大叶茜草素对照品10.31 mg，置于100 mL容量瓶内，加甲醇溶解至刻度，超声处理，制成每1 mL含大叶茜草素0.1 mg的大叶茜草素对照品溶液.精密称取羟基茜草素对照品10.02 mg，置于100 mL容量瓶内，加甲醇溶解至刻度，超声处理，再用移液管移取4 mL溶液于10 mL容量瓶中，超声处理，制成每1 mL含羟基茜草素40 μg的羟基茜草素对照品溶液.按照上述方法，制成每1 mL含茜草素40 μg的茜草素对照品溶液.用前以0.45 μm微孔滤膜过滤.

1-茜草素 2-羟基茜草素 3-大叶茜草素图1　对照品溶液(A)、样品溶液(B)HPLC色谱图

2.3供试品溶液的制备

使用小型粉碎机将茜草饮片粉碎成细粉过二号筛，精密称取茜草药品约0.5 g，置于锥形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，称定质量，放置过夜，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失质量，摇均，滤过，精密量取续滤液50 mL，蒸干，残渣加甲醇-25%盐酸(4∶1)混合溶液20 mL溶解，置水浴中加热水解30 min，立即冷却，加入三乙胺3 mL，混均，转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇均，滤过，取续滤液，即得.用前以0.45 μm微孔滤膜过滤.

2.4精密度试验

精密吸取同一供试品溶液10 μL，按上述色谱条件连续重复进样6次，测得大叶茜草素峰面积RSD(n=6)为0.62%；羟基茜草素峰面积RSD(n=6)为0.63%；茜草素峰面积RSD(n=6)为0.58%，表明仪器精密度良好.

2.5重复性试验

取同一份茜草药材0.5 g，共5份，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，在上述色谱条件下测定测得大叶茜草素峰面积RSD(n=5)为1.35%；羟基茜草素峰面积RSD(n=5)为1.03%；茜草素峰面积RSD(n=5)为1.31%，表明该方法重复性良好.

2.6稳定性试验

取同一份供试品溶液10 μL，分别于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h进样，测得大叶茜草素峰面积RSD(n=9)为1.25%；羟基茜草素峰面积RSD(n=9)为0.67%；茜草素峰面积RSD(n=9)为1.45%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定.

2.7加样回收率试验

取同一份已知百分含量的茜草样品0.5g共6份，精密称定，置于具塞锥形瓶内，每份精密加入含大叶茜草素、羟基茜草素、茜草素对照品溶液1 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，计算平均回收率分别为99.38% (RSD=1.94)、98.14% (RSD=1.29)、95.91% (RSD=1.57)，表明该方法准确度良好，符合规定.

2.8校正因子的计算

取2.2项下不同体积的对照品溶液，按上述色谱条件分别进样10 uL，测定各成分峰面积.以大叶茜草素为内标物，按公式fk/m =fk/fm=Wk×Am/(Wm×Ak) ，其中Ak为内标物峰面积，Wk为内标物质量，Am为其他组分的峰面积，Wm为其他组分的质量或浓度.分别计算羟基茜草素、茜草素的校正因子，结果见表1.

表1　不同体积对照品溶液对相对校正因子的影响

2.9相对校正因子的重现性

取2.2项下对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，考察两种高效液相色谱仪Agilent、Waters和两种色谱柱DiKMA、Waters测得的相对校正因子，见表2.

表2　不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响

2.10色谱峰专属性

一测多评在应用于定量测量时，由于只用到了一个对照品，其他待测成分无对照品，无法准确确定待测组分峰的位置，因此，对成分峰进行定位是一测多评法要解决的关键问题之一[5].本研究分别采用各待测成分间的保留时间差、相对保留值2种参数作为定位标准，在两种高效液相色谱仪Agilent、Waters和两种色谱柱Agilent、Waters下进行考察.结果表明，不同仪器和色谱柱下个成分间保留时间差波动较大，相对保留值波动较小，因此选用相对保留值作为上述目标色谱峰的定位指标比较合适.以相对保留值结合各色谱峰的紫外吸收特征能够判断目标峰的峰位置.相对保留值见表3.

表3　茜草中各组分的相对保留值

2.11一测多评法与外标法结果比较

取10批茜草药材，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相百分含量测定.采用外标法和一测多评法计算茜草药材中大叶茜草素、茜草素、羟基茜草素百分含量，结果见表4.外标法实测值与一测多评计算百分含量值经t检验比较，无显著性差异.由此说明一测多评法可用于茜草药材的多成分百分含量测定.

表4　茜草中各有效成分的“一测多评”法与外标法结果比较

3　讨　论

茜草中大叶茜草素为萘醌类有效成分，羟基茜草素和茜草素为蒽醌类有效成分，天然蒽醌类化合物有抗菌消炎、抗肿瘤、对心脑血管作用、对中枢系统作用，同时蒽醌类化合物对动物或人体的正常细胞存在一定的对性作用[6-8].为了更好地利用茜草这一药材，就不得不考虑其进行更深一步的研究.目前中药化学对照品价格昂贵并且难以制得，种类和数量还不能满足质量检测和新药研发的需求.大叶茜草素为茜草中主要有效成分，对照品较容易得到，因此被选为内标物，利用“一测多评”法测得茜草中其余2种有效成分，建立了大叶茜草素与其余2种有效成分的相对校正因子.一测多评法实现了在对照品缺乏的情况下，进行中药多成分定量和多指标质量控制，显著降低了成本，提高了效率.

[1]CHEN S B, FENG R Z, CHEN B Z,etal. A study on the medicinal plants of genus Rubia.I.Botanical Origins and Resource of Chinese traditional drug “Qian Cao” (Madder)[J], Natural Product Research and Development, 1991,3(4): 8-15.

[2]王晓建,黄胜阳. 茜草属植物化学成分及其药理作用研究进展[J]. 中国中医药信息杂志, 2012, 19(2): 109-112.

[3]王智民, 高慧敏, 付雪涛, 等. “一测多评”法中药质量评价模式方法学研究[J]. 中国中药杂志, 2006, 31(23): 1925-1928.

[4]沈小钟, 刘瑶, 杨燕军, 等. 一测多评法研究进展[J]. 中国药业, 2013, 22(13): 1-5.

[5]陆兔林,石上梅,蔡宝昌,等. 基于一测多评的中药多成分定量研究进展[J]. 中草药, 2012, 43(12): 2525-2529.

[6]王素贤, 华会明, 吴立军, 等. 中药茜草的研究进展[J]. 沈阳药学院学报, 1990, 7(4): 303-308.

[7]杨念云,田丽娟. 茜草属植物的化学成分和药理作用[J]. 国外医药:植物药分册, 2005, 20(2): 53-55.

[8]李鹏,胡正海. 茜草的生物学及化学成分与生物活性研究进展[J]. 中草药, 2013, 44(14): 2009-2014.

Determination of three active ingredients in Radix Rubiae by quantitative analysis of multi-components with single-marker

WANG Rui, CAO Ying, WANG Zhi-bin

(Heilongjiang University of Chinese Traditional Medicine, Harbin 150040, China)

To establish quantitative analysis of multi-components with a single-marker (QAMS) for determining contents of three active ingredients from Radix Rubiae. Contents of three active ingredients in Radix Rubiae were determined by HPLC. It was used with acetonitrile-0.2%phosphoric acid solution (43∶57) as the mobile phase, the flow rate was 1.0 mL/min, the detection wavelength was set at 250 nm. With Rubimaillin as a internal standard, relative correlation factors (RCF) of Purpurin, Alizarin to Rubimaillin were calculated, contents of these three ingredients were determined by the external standard method and QAMS, respectively. Results indicated that these two methods did not show significant difference in assay results of contents of these three ingredients with similarity of 0.99. QAMS could be used for quality control of Radix Rubiae.

quantitative analysis of multi-components with a single-marker; Radix Rubiae; rubimaillin; purpurin; alizarin

2016-01-16.

黑龙江省自然科学基金(H201472)

王锐(1977-)，男，硕士，副教授，研究方向：新药研发及新剂型研究.

王知斌(1976-)，男，博士，副教授，研究方向：中药药效物质基础研究.

R284

A

1672-0946(2016)04-0426-03