不同产地茜草药材UPLC指纹图谱研究及化学计量学分析

王闽予，何民友，李国卫，邓淙友，孙冬梅

(1.广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

茜草始载于《神农本草经》，原名“茜根”，为茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根和根茎，味苦，性寒，归肝经，具有凉血、祛瘀、止血、通经的功效，用于吐血、衄血、崩漏、外伤出血、瘀阻经闭、关节痹痛、跌扑肿痛[1]。茜草中主要含有蒽醌及其苷类、萘醌及其苷类、环己肽类、多糖类、萜类等成分[2-4]，具有抗肿瘤、升高白细胞及免疫调节、护肝、抗风湿、抗氧化、止血、抑菌等作用[5-7]。茜草主产于安徽、江苏、山东、河南、陕西等地，以陕西、河南出产者量大且质优[8-10]。

2015年版《中国药典》中以大叶茜草素、羟基茜草素作为评价茜草药材质量的指标。中药材来源广泛，成分复杂，以单个或几个目标成分的检测和控制难以反应药材的质量[11]。中药指纹图谱技术可以整体、宏观地表征被测样品主要化学成分的特征，是目前公认的最适合中药物质群质量控制的手段之一，用于中药质量的整体评价[12-15]。本研究建立茜草药材的UPLC指纹图谱，并结合聚类分析和相似度评价对不同产地的茜草药材进行评价，为全面评价茜草药材质量提供参考。

1 仪器与材料

Waters H-Class型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Waters CORTECS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；ME204E型万分之一天平(10 mg～220 g，d=0.1 mg)、XP26型百万分之一天平(量程22 g，d=0.001 mg)(瑞士梅特勒-托利多公司)；HWS-28型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；KQ500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率500 W，频率40 kHz)；Milli-Q Direct型超纯水系统(美国默克股份有限公司)。

羟基茜草素对照品(批号：111898-201603；质量分数：98.5%)、大叶茜草素对照品(批号：110884-201606；质量分数：99.5%)、茜草对照药材(批号：121049-201705)均由中国食品药品检定研究院提供；三乙胺、三氟乙酸、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

茜草样品经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根和根茎，18批茜草药材信息详见表1，均符合2015年版《中国药典》规定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters CORTECS UPLC T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；进样量为2 μL；柱温为30 ℃；检测波长为260 nm；以甲醇为流动相A，以含0.2%三乙胺和0.2%三氟乙酸的溶液为流动相B，按表2进行梯度洗脱，流速为0.3 mL/min。

表1 18批茜草药材信息表Table 1 Information of 18 batches of Rubia cordifolia L.

表2 梯度洗脱程序表Table 2 Gradient elution

2.2 对照品溶液的制备

取羟基茜草素、大叶茜草素对照品适量，加甲醇制成羟基茜草素质量浓度为36.33 μg/mL、大叶茜草素质量浓度为31.98 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 对照药材溶液的制备

取茜草对照药材0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-25%HCl溶液(体积比4∶1，下同)100 mL，称定质量，加热回流60 min，放冷，再称定质量，用甲醇-25%HCl溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材溶液。

2.4 供试品溶液的制备

取茜草粉末(过二号筛)适量，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-25% HCl溶液(4∶1)100 mL，称定质量，加热回流60 min，放冷，用甲醇-25% HCl溶液(4∶1)补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 精密吸取茜草药材(批号S4)供试品溶液，按“2.1”项色谱条件重复进样6次。以羟基茜草素峰为参照峰(S峰)，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积RSD值分别为0.05%～0.33%、0.56%～1.49%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 精密吸取茜草药材(批号S4)供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，以羟基茜草素峰为参照峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积RSD值分别为0.05%～0.45%、0.41%～1.41%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.3 重复性试验 取同一批茜草药材(批号S4)粉末平行6份，按“2.4”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定。以羟基茜草素峰为参照峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积RSD值分别为0.09%～0.33%、0.98%～2.67%，表明方法重复性良好。

2.6 指纹图谱的建立与分析

2.6.1 茜草药材指纹图谱的建立 取18批茜草药材，按“2.4”项方法制备供试品溶液，取上述18批供试品溶液及茜草对照药材溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定。茜草药材对照指纹图谱见图1，茜草对照药材指纹图谱见图2，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对18批茜草药材指纹图谱进行共有峰标识，结果见图3。

121620242832364044048t/minR(9)200150100500240U/mV7896(S)54321

121620242832364044048t/min20016012080400U/mV123456(S)789

10009008007006005004003002001000U/mVS18S17S16S15S14S13S12S11S10S9S8S7S6S5S4S3S2S1121620242832364044048t/min1234576(S)98

2.6.2 共有峰的确定 对18批茜草药材指纹图谱进行分析，共有9个特征峰，经与对照药材参照物色谱进行比对，指认了其中的5个特征峰，分别是3号峰山柰素、5号峰茜草素、6号峰羟基茜草素、7号峰1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌、8号峰大叶茜草素，羟基茜草素的峰面积较大、分离度较好，故以其为参照峰(S峰)，计算各特征峰与S峰的相对保留时间与相对峰面积，并计算RSD值，结果见表3、表4。可见，以羟基茜草素峰为参照峰，18批茜草药材指纹图谱的其余8个特征峰相对保留时间RSD值在0.25%～1.50%，均小于3.0%；18批茜草药材指纹图谱的9个特征峰相对峰面积的RSD在19.07%～70.84%，结果表明不同产地茜草药材的各特征峰峰面积存在一定差异。

2.6.3 相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012年版)，以茜草对照药材指纹图谱为参照，进行整体相似度评价，除S4相似度较低为0.637之外，其余17批不同产地茜草药材的相似度为0.871～0.983，见表5。

表3 18批茜草药材指纹图谱相对保留时间测定结果Table 3 Relative retention time of 18 batches of Rubia cordifolia L.

表4 18批茜草药材指纹图谱相对峰面积测定结果Table 4 Relative peak area of 18 batches of Rubia cordifolia L.

表5 18批茜草药材 UPLC指纹图谱相似度结果

2.7 聚类分析 将18批茜草药材指纹图谱的9个共有峰的相对峰面积导入SPSS20.0软件，采用Eu-clidean距离进行聚类分析，结果见图4，当类间距离为25时，18批茜草药材可分为2类，S6～S7、S9～S11、S17～S18为一类，包含6批河南省和1批山东省样品，S1～S5、S8、S12～S16为一类，包含5批河北省、2批河南省及陕西省、山西省、山东省各1批样品。

910761117185151213141681234S9S10S7S6S11S17S18S5S15S12S13S14S16S8S1S2S3S4Y0510152025

2.8 大叶茜草素、羟基茜草素质量分数的测定

2.8.1 线性关系考察 取羟基茜草素和大叶茜草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含羟基茜草素204.0 μg、大叶茜草素170.1 μg的混合对照品储备液。精密量取上述混合储备液0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得对照品线性溶液。精密吸取对照品线性溶液和混合对照品储备液各2 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样测量，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(y)、对照品质量浓度为横坐标(x)绘制标准曲线，得到线性回归方程：羟基茜草素，y=48 068.341 3x-25 699.997 6，r=0.999 7，线性范围2.040～204.0 μg/mL；大叶茜草素，y=28 091.977 5x-7 320.780 9，r=0.999 6，线性范围1.702～170.1 μg/mL。

2.8.2 精密度试验 精密吸取茜草药材(批号S4)供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，计算羟基茜草素、大叶茜草素峰面积的RSD值分别为0.07%、0.25%，表明仪器精密度良好。

2.8.3 稳定性试验 精密吸取茜草药材(批号S4)供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，计算羟基茜草素、大叶茜草素峰面积的RSD值分别为0.38%、0.99%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8.4 重复性试验 取同一批茜草药材(批号S4)约0.5 g，精密称定，平行称定6份，按“2.4”项下确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。按“2.1”项下色谱条件测定，计算羟基茜草素、大叶茜草素峰面积的RSD值分别为1.68%、1.24%，表明方法重复性良好。

2.8.5 加样回收率试验 取同一批茜草药材(批号S4，大叶茜草素的质量分数为4.40 mg/g，羟基茜草素的质量分数为3.62 mg/g)，约0.25 g，精密称定，分为3组，每组平行称定3份，分别按1∶0.5、1∶1、1∶1.5加入对照品，按“2.4”项方法制备供试品溶液9份，按“2.1”项色谱条件进行测定，计算羟基茜草素、大叶茜草素的平均加样回收率分别为103.5%、98.8%，RSD值分别为2.67%、2.60%，表明方法准确度良好。

2.8.6 样品测定 取18批茜草药材，按“2.4”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，18批茜草药材中大叶茜草素、羟基茜草素的质量分数测定结果见表6。可见，18批茜草药材的大叶茜草素质量分数范围为0.47%～1.18%，羟基茜草素的为0.36%～0.9%，其中S6、S7、S9、S10、S11的大叶茜草素质量分数较高，分别为1.18%、1.06%、0.94%、0.81%和0.81%，S17、S18的羟基茜草素质量分数较高，分别为0.90%和0.81%，表明河南省产的茜草药材质量较优。

表6 18批茜草药材中2种成分的质量分数测定结果

3 讨论

本研究对检测波长、色谱条件、供试品制备等进行了考察，经紫外-可见全波长(190～400 nm)扫描，发现在260 nm处各色谱峰较响应值较均匀，各色谱峰信号较强，基线平稳，干扰较小，因此选择260 nm作为检测波长；同时对甲醇-含0.2%三乙胺和0.2%三氟乙酸溶液、乙腈-含0.2%三乙胺和0.2%三氟乙酸溶液、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.3%甲酸、甲醇-0.2%三乙胺和甲醇-0.2%三氟乙酸等不同组成的流动相进行了考察，结果以甲醇-含0.2%三乙胺和0.2%三氟乙酸溶液梯度洗脱样品分离较佳。对CORTECS T3(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)、YMC C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、Waters HSS T3 C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)4种品牌色谱柱的色谱图进行比较，发现不同品牌色谱柱对各特征峰分离影响较大，使用CORTECS T3(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)色谱柱各特征峰分离效果较好。在供试品溶液前处理中对比三乙胺用量、不同提取溶剂、提取方式及提取时间，发现使用甲醇-25%盐酸(4∶1)混合溶液100 mL加热回流60 min为最佳。

运用相似度评价、聚类分析2种方法对不同产地茜草药材UPLC指纹图谱进行分析。以茜草对照药材指纹图谱为对照，除S4相似度较低为0.637之外，其余17批不同产地茜草药材的相似度为0.871～0.983，全部在0.8以上，说明不同产地药材表现出了良好的相似度。聚类分析结果，除了2批河南省和1批山东省的药材之外，可以将剩余河南省药材与其他省份药材区分开来，说明河南省所产茜草药材质量比较相近，其他省份茜草药材质量与之不同。含量测定结果显示，河南省所产茜草药材中大叶茜草素和羟基茜草素的质量分数较高，质量较优，与聚类分析的结果相吻合。

本研究建立了茜草药材的UPLC指纹图谱方法，共生成9个共有峰，较普通液相分析时间缩短了40 min，结合化学计量学分析，可较好的区分河南省与其他省份所产茜草药材，为茜草药材的综合评价提供了参考。