植物抗性基因NPR1研究进展

韩永光，马利刚，赵 乐，冯卫生，郑晓珂*

(1.河南中医药大学药学院，河南郑州 450046；2.呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心,河南郑州 450046)

病程相关基因非表达子1 ( nonexpressor of pathogenesis-related genes 1，NPR1)是多个抗病性信号传导通路的交叉点，是调节植物整体抗病性的重要作用因子，又称为NIM1 或SAI1。植物如果缺少NPR1的功能，就会导致病程性相关蛋白质PR基因表达的受损和在应对病虫害侵害时，系统性获得抗性 (Systemic Acquired Resistance，SAR)的抵抗作用几乎全部缺失。通过对DNA序列进行比对分析，结果显示NPR1启动子中含有相对保守的28个核苷酸序列，这些序列组成3个W盒，其中1个反向排列，2个顺向串联。NPR1启动子必需与WRKY蛋白结合后才能发挥作用，如果W盒中的某个核苷酸被替换，则不能与WRKY 蛋白发生结合[1]。NPR含有多个锚蛋白重复序列和1个BTB/POZ区，NPR1在细胞核内主要是负责SA-介导PR-1基因的诱导表达，而其在细胞溶质中主要在SA和JA信号通路中发挥重要的拮抗作用[2]。

在细胞溶质中NPR1通过氨基酸顺序的第82和216位半胱氨酸残基分子间的二硫键结合形成寡聚体，可通过硫氧还蛋白H5或H3还原2个半胱氨酸残基(Cys82和Cys216)调控细胞液中的氧化还原状态，NPR1低聚物二硫键迅速被还原, 形成单体。NPR1单体随后由细胞溶质转移到细胞核中，在核中激活防御基因的转录。突变这2个半胱氨酸中的任何一个都能导致核定位单体NPR1水平的升高，而核定位单体NPR1与不断上调PR基因的表达密切相关[3]。

1 NPR家族

最新研究表明NPR蛋白家族包括研究相对多的NPR1和另外5个可能编码NPR 1相关基因(NPR2-6)，其共同点是均含有保守BTB / POZ、锚蛋白的相关蛋白重复结构域和高度保守半胱氨酸残基。NPR3是免疫信号SA的受体，可作为泛素E3配体的调节器，以一种SA调节的方式调控npr1的降解。npr3突变体积累了较高水平的npr1，对SAR诱导不敏感。该突变体在病原体效应诱发细胞程序性死亡和免疫方面存在缺陷[4]。NPR4与NPR1具有36%的同源性，并与转录因子TGA相互作用。NPR4 mRNA水平的表达量会随病原体的侵入和SA的处理而激增，但JA的处理则会导致其表达水平的下降， NPR4主要在抗病原体的基础防御起到必需的作用，而且它可能与SA和JA依赖的信号通路之间的交叉通路有关[5]。NPR5又称为BOP1 ，BOP1能编码一个具有锚蛋白重复序列的BTB/POZ 域的蛋白。BOP1属于一类小基因家族成员，其中包括比较典型的抗病调节蛋白NPR1。 BOP1在调控叶片形态形成和分化起关键作用[6]。NPR6又被称为BOP2，BOP2同样能调节叶片的发育，最新研究表明BOP2能通过减少PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4(PIF4)蛋白水平，促进光生形态的形成，并通过抑制PIF4活性来调节热形态发生[7]。NPR2功能研究尚不清楚，有文献表明NPR2与NPR1序列相似性高，功能类似，同样对SA比较敏感[8]。

2 NPR的抗性

通过转基因技术手段将NPR1基因转入到拟南芥突变体npr1后，突变株不仅能在表型上有所改观，其SAR的能力也得到恢复，PR基因的表达和植物的抗性能力得到增强。即使在无诱导的条件下，同样具有很强的抗性能力[9]。有文献表明在NPR1基因的过量表达植株具有增强植物的抗病能力，且无其他不良的负效应[10]。Chern等[11]在过量表达拟南芥NPR1基因的水稻中证实NPR1基因在单子叶植物中所扮演的作用，发现转基因水稻植株能提高对水稻细菌性枯叶病原体的抗性能力，而且RNA点杂交试验表明NPR1基因的高表达能提高抗病能力，首次确定NPR1基因可以提高单子叶植物的抗病能力。而过量表达NPR1基因的转基因拟南芥和水稻中则能够显著地增强植株抗病性，结果表明NPR1是SAR信号转导途径中作用于SA下游的一个关键性调控因子。在SAR诱导条件下，拟南芥npr1突变体能积累正常的SA浓度, 但是不能有效地激活SAR，更不能积累PR蛋白，从而不能高效地提高植物的抗性，npr1突变体表现为对病原体更加敏感，使抗病R基因参与形成的抗病能力得到降低，表明NPR1在感染位置限制病原菌生长方面发挥重要作用。

荷兰科学家Pieterse等[12]发现NPR1同样在诱导性系统抗性(induced systemic resistance,ISR)中具有重要的作用。在npr1突变株中，ISR不能被ISR诱导菌Pseudomonas fluorescens诱导激发。经过SA和JA同时处理植株叶片后，SA能抑制JA相关基因的诱导表达，但在NahG转基因植株侵染PstDC3000后，SA的含量没发生明显地变化，而JA水平却增加了25倍，参与JA信号传导途径的相关基因表达量也显著地增强，在npr1突变体的植株中, 这种抑制作用显著减弱[2]。说明NPR1在SA介导的SAR和JA介导的ISR中均具有重要免疫调节作用。在jar和etr突变体中ISR防御生理过程受抑制，结果表明ISR过程需要JA和C2H4等信号参与。生态型为RLD和Ws的拟南芥中ISR受到抑制，使得拟南芥对C2H4的刺激不敏感。而eds4和eds8突变体分别对C2H4和JA的处理不敏感，ISR生理过程反应也受到抑制。但另一种eds的突变体eds10对C2H4和JA均能做出免疫反应，进而能激活SAR反应，但不能激活ISR反应。表明EDS10是ISR中一个很重要的作用因子。在整个ISR反应过程中，同时还需要位于JAR1和ETR1下游的NPR1的参与[12]。因此，可以证实NPR1是诱导SA或JA/C2H4防卫反应的一个重要的调节因子。而大量试验表明SA的积累会导致JA的生物合成和JA调节基因表达的抑制。对野生型和SA、JA和C2H4缺失的突变体进行大规模研究分析发现，尽管SA信号转导途径能被JA/C2H4抑制，但SA对JA信号转导途径的抑制更为普遍[13]。另外发现用SA和JA处理拟南芥可以抑制JA调节的基因的表达[2]，而对npr1突变体进行研究发现SA对JA的拮抗效应需要NPR1参与。与激活SAR不同，NPR1不参与抑制JA信号转导途径。因此，可以说NPR1是植物防御免疫反应(包括SAR、ISR、SA/JA 交叉转导)的关键调控因子。

赵利辉等[14]从多种病原真菌中分离纯化出一种新的42 kD耐热蛋白，被称之为植物激活蛋白(plant activator protein)，研究发现其对TMV和CMV等多种植物病菌都具有一定的抗性。cDNA芯片试验表明该蛋白可诱导NPR1和乙烯受体相关基因等抗病基因的转录，他们检测该激活蛋白处理水稻叶片能引起水稻NPR1的转录水平显著提高，促进抗病蛋白如PR蛋白的积累，提高其抗性。说明植物体内某些热激蛋白也可能与NPR1发生相互作用。npr1突变体植株对SAR多种诱导介质如SA、INA均不能明显作出抗性应答, 表现为PR基因的表达几乎无明显变化，而且更容易感染细菌和真菌病毒等病菌。而使用外源性SA 或人工合成的类似物质，例如IN A可使PR基因的表达得到诱导和可较强地激活SAR[15-16]。另外有研究发现NPR1基因不仅在SA介导的SAR以及根围细菌介导的ISR中具有重要作用, 而且在抑制JA信号分子介导的防卫反应方面也发挥着重要作用。

尽管在NPR1蛋白的研究过程中发现由SA 介导SAR信号传导途径大多为NPR1蛋白依赖型，然而有研究发现存在一种不依赖于NPR1蛋白的信号传导途径。抗性拟南芥生态型Di-17植株感染芜菁卷曲病毒(TCV)后，证实HR的形成和对TCV 抗性均依赖于SA途径，而非依赖于乙烯和茉莉酸， 并且NPR1 基因突变不能影响这些生理过程，表明拟南芥的TCV抗性存在一条仍未确定的依赖SA而不依赖NPR1的信号转导途径[17]。在烟草研究证实TMV抗性是由一条依赖于SA似乎还需要交替氧化酶( Alternative Oxidase, AOX) 的介导途径的，奇怪的是SHAM(一种AOX活性的抑制物质)可抑制TMV抗性，而不能抑制PR表达的TMV诱导性的激活抗性, 另外细菌或真菌病原体的抗性并不会受到SHAM处理的影响。因此，烟草中可能存在至少2条不同的SA调控防御途径: 一条认为是依赖于NPR1且调控PR基因的表达以及抗细菌和病原体;而另一条可能是不依赖于NPR1也能激活病原体抗性[18-19]。Bowling等[20]筛选出来的拟南芥cpr突变株存在2种调控转导途径——依赖NPR1和不依赖NPR1的SAR途径的组成表达，这种现象说明这2种调控转导途径在早期的信号转导过程是相互关联的，而且在病毒抗性方面可能存在重叠效应。

3 NPR与转录因子的相互作用

酵母双杂交试验表明与NPR1直接相互作用的蛋白主要是bZIP转录因子的TGA家族的多个成员，还有就是其他3种蛋白NIMIN1，2和3(NIM1-相互作用蛋白1，2和3)[21]。Zhang等[22]通过试验证实NPR1 能与TGA 转录因子发生相互作用，从而调节NPR1的表达。NPR1上4个关键点的任何一个发生突变，均能导致NPR1 不能与TGA发生作用。而这种相互作用是调节PR基因表达所必需的，说明NRP1可能通过TGA调控PR基因的表达和增强植物的抗病能力。TGA转录因子是b ZIP转录因子家族非常重要的组成部分，其含有DNA结合域和亮氨酸拉链，能与顺式作用元件相结合，从而调控基因的表达[23]。虽然在经过SA处理后，拟南芥中NIMIN1，2和3被诱导的相对持续时间较短，但NIMIN1表现为负调控SA/NPR1信号通路。过量表达NIMIN1导致ETI和SAR的钝化效果。而减少NIMIN1的表达则PR-1基因的表达能通过SA得到增强[24]。在酵母中，NPR1可与5个不同的拟南芥TGA因子相互作用，而在高等植物中NPR1可与7个不同的拟南芥TGA因子相互作用[25]，而在经过SA处理的拟南芥叶片中，仅检测到TGA1和TGA4与NPR1相互作用。这种相互作用依赖于SA诱导的氧化状态环境的变化，从而导致TGA1和TGA4 2个特有的半胱氨酸残基Cys-260 和Cys-266的还原。在非诱导情况下, 这2个氨基酸残基以氧化状态存在, 以二硫键结合, 防止与NPR1 结合；当SA处理诱导后, 二硫键被还原，使得TGA蛋白与NPR1相互作用，从而激活基因表达，增强抗性[26]。在无SA存在的情况下，TGA2也能与NPR1相互作用，但在SA处理叶片中，这一相互作用可增强[27]。然而，TGA2和TGA3激活抗病基因转录需要SA和NPR1。因为NIMIN1在酵母中能与TGA2、TGA6、NPR1和PR-1启动子区域形成复合体，这一复合体可能调控TGA依赖的SA调节基因的转录激活[24]。

4 展望

NPR1是植物抗病性的关键调控转录因子，涉及多种抗性途径，现已知在多种经济作物中均含有NPR1或高度同源的基因，在植物保护中具有重要的研究价值，因此可以通过转基因等技术工程手段将NPR基因应用于植物保护等方面，在植物抗病害等方面应用前景广阔。实际上，科学家已经构建转基因NPR1拟南芥和水稻等植物，对它们在抗性方面的研究也取得重要的成绩。很多研究表明过量表达NPR1的单子叶或双子叶植株均表现出对多种致病病原体具有良好的抗性，因此在减少植物病害、增加作物产量方面，NPR1具有巨大的应用潜力和研究价值。如通过构建转基因植株，特异性高诱导NPR1的表达激活植物防御机制，诱导植物抗性。通过筛选、分离和鉴定植物的抗病突变体。同时，还可以筛选一些能够激活植物SAR的小分子化合物；尽管科学界对NPR1的研究取得很大的进展，但是仍然有许多问题还没有得到解决，如：SA激活NPR1基因表达是否涉及其他代谢分子，还需要进一步深入研究；不同TGA转录因子成员如何互相协调共同调控NPR1信号传导途径；NPR1如何在植物体内有机地调控不同的信号传导途径，将涉及SA、ET和JA的信号之间有机联系在一起；NPR1和SA等信号途径之间是否还存在其他不同的调控因子；NPR1结合蛋白与NPR1的相互作用机制尚不完全清楚；通过分子生物学、基因工程等多种技术手段，应该能够获取更多与NPR1相互作用的因子或调节基因，有助于对NPR1作用机理的了解， 为进一步研究植物抗病防治机制做贡献。