中华鳖高雄性率调控技术研究进展

郑 露，蒋业林*，程云生，侯冠军，王 芬，季索菲，王佳佳，李 翔

(1.安徽省农业科学院水产研究所，安徽合肥 230031；2.安徽省鳖类良种繁育与健康养殖工程技术研究中心，安徽蚌埠 233000，3.安徽省喜佳农业发展有限公司，安徽蚌埠 233000)

中华鳖(Pelodiscussinensis)隶属于爬形纲龟鳖目，营养价值高，是我国广为分布和养殖的名贵食用水产动物[1]。近年来，我国中华鳖人工养殖发展迅速，但病害却十分严重，控制传染病的发生和蔓延，对提高养鳖效益、降低生产成本尤为重要。在中华鳖实际生产和科研探索历程中，发现中华鳖雄性个体比雌性个体生长速度快，裙边厚实，胶原蛋白丰富，发病少，养殖成活率高，不管是养殖户还是消费者更加青睐于雄性中华鳖的养殖和食用。因此，在生产中提高中华鳖的雄性率对于推动中华鳖产业更快更好地发展具有重要意义。

有关爬行类的单性控制，国外学者曾做过一些研究，Bull[2]报道，爬行类中有些种类的性别决定与孵化温度密切相关。国外研究成果中也涉及到多种性激素对龟鳖类性别控制技术的报道，Bentley[3]指出雌性黄喉水龟血浆中的雌二醇含量在产卵前后期处于波动状态，含量较高时出现在产卵前，含量较低时出现在刚产完卵和产卵后期。卵产出后，卵巢内的卵泡逐渐变大，血浆中的雌二醇含量随之升高。说明雌二醇能够刺激黄喉水龟卵的发育，促进卵的成熟。

国内有关中华鳖的性别控制研究的报道中，温度和外源激素是常用于中华鳖性别分化调控的关键因子，而外源激素中的雌二醇、甲基睾丸酮、芳香化酶抑制剂是研究最多的激素种类。通过对最新相关研究文献综述，并对有关技术的应用前景进行分析，以指导中华鳖高雄性人工诱导技术在生产上广泛应用，促进该产业生产效率的提高。

1 中华鳖高雄性率研究

1.1孵化温度孵化温度对于大部分鱼类、两栖类、爬行类动物的性别分化和性腺发育影响显著，大多数龟鳖目动物都具有温度依赖型性别决定(temperature-dependent sex determination，TSD)，温度对影响中华鳖孵化和发育的作用很大，具体表现在孵化温度可以决定稚鳖的性别比例、影响孵化周期的长短和孵化率的高低[4]。

针对温度对于中华鳖性别分化等的影响方面，国内外很多学者都做了大量研究。罗曼等[5]认为孵化温度在(27～29)±0.5 ℃，分期前保持湿度85%，孵化率可以达到95%以上，并且在24～26 ℃时，孵化出来的个体中雄性和雌性的比例大于1，温度在26.0～27.5 ℃时，孵化出来的个体中雄性和雌性的比例小于1。阮成旭等[6]在32 ℃条件下孵出的雄性比例为64.1%，32 ℃孵化出的雌性比例是34.3%，与聂刘旺等[7]的结论和以上结果相差无几，认为在29 ℃孵化下性别比例接近1∶1。巫旗生等[8]研究发现，中华鳖在32 ℃孵化雄性率高，27 ℃孵化雌性率高。

目前，关于孵化温度对中华鳖性别分化的影响仍然有争议，就温度在32 ℃情况下中华鳖雄性率的研究结果也有差异。任少亭等[9]在该温度下雄性孵化率为85%，朱道明等[10]认为同温度下雄性孵化率为88%。也有部分研究认为，鳖卵孵化有2个极限温度，孵化温度在<26 ℃和>36 ℃的情况下，胚胎无法成活，温度在26～30 ℃雌性个体居多，在30～34 ℃时，雌雄个体都有，而在34～36 ℃时雄性个体占比较大。这些研究结果的差别可能与孵化介质、湿度以及所处环境有很大关系。虽然试验结果不同，但均表明孵化温度确实可以影响中华鳖的性别。综合大量试验表明：在一定温度(26～36 ℃)范围内，随着温度升高，中华鳖雄性率提高，最适孵化温度在32 ℃左右，雄性率最高可达90%以上。

1.2外源激素动物性别的决定和性别的分化与很多因素有关，除了基因和温度对性别分化有重要影响外，众多类固醇激素也起到关键的调控作用。在众多外源激素中，雌二醇、甲基睾丸酮、芳香化酶抑制剂对于中华鳖性别分化的影响最大。

1.2.1雌二醇。雌二醇(Estradiol，E2)是雌激素中的一种天然激素，作用于性腺分化不明显时期，能够有效调节脊椎动物卵巢的生长和发育，刺激并诱导性腺向雌性方向转化，诱导性腺快速成熟[11]。

方永强等[12]在鲻鱼性别未分化期，喂食添加E2的饲料，鲻鱼可全雌发育，且比未经处理的鲻鱼发育快，进入性成熟。在卵巢分化时期，E2处理可降低睾酮的水平，从而改变雌雄激素比例，诱导雌性化的发生。E2在性腺未分化时期促进其发育，在性腺发育成熟后，亦可改变其性别。温茹淑等[13]用E2作用于性腺发育成熟的剑尾鱼，发现精巢内的精小囊数量减少，精原细胞发育停滞，精子数量稀少甚至没有。孙鹏[14]用E2处理雄性中华绒螯蟹后，雄性性腺的继续发育受到抑制，性腺退化，并且逐渐朝雌性发育，造成这种现象期主要是由于雄性特异基因表达的降低和雌性特异基因表达的增高。

唐瑶[15]在中华鳖卵性别分化期注射E2，发现E2等能够明显减少中华鳖的孵化时间，且孵化的中华鳖全部为雌性。将添加E2的饲料投喂给刚孵化的雄性稚幼鳖，性别并未像前面报道的剑尾鱼一样发生性别转化，说明雌二醇不能使已孵化出卵的中华鳖性别特征发生改变。王莉等[16]在中华鳖性腺分化早期使用E2对胚胎进行处理，发现E2能显著降低雄性性别关键因子DMRT1、SOX9 mRNA 和蛋白表达水平，从而抑制雄性分化，促进卵巢细胞发育。可见一定浓度的雌二醇对于中华鳖分化为雌性个体具有很好的诱导作用，但是超过一定浓度以后，随着浓度的增加雌性率下降。

1.2.2甲基睾丸酮。甲基睾丸酮(MT)又名甲基睾丸素，是一种人工合成的雄性激素，一般为白色或乳白色结晶性粉末，能够促进雄性动物精巢的发育和成熟，在水产领域应用较多。在鱼类性腺诱导方面作用明显，且不同浓度对各种鱼类有不同的生物学作用，国内外有大量研究报道。国内张虹[17]将拌有100 μg/g的17-α-甲基睾丸酮的饲料投喂于雌核发育的草鱼，发现73.3%个体性腺有向精巢发育的趋势，且有23.3%的个体性腺发育迟缓，出现畸形，而对照组性腺发育正常，雌雄比例均衡，表明17-α-甲基睾丸酮能有效诱导雌核发育草鱼性腺向雄性转化。

范俊杰等[18]研究不同浓度MT对雌性食蚊鱼形态雄性化的影响，设置4个浓度梯度(0、5、50、500 nmol/L)，采用浸浴法处理生长发育期间的雌性个体，结果表明MT雌激素效应明显，且浓度在50～500 nmol/L范围内，随着浓度增大，雌鱼在生长发育过程中出现形态雄性化比例增大。

国外相关研究报道也比较多，Bhandari等[19]用MT处理尼罗罗非鱼雌性个体，结果表明在性别分化期外源性雄激素通过抑制类固醇关键酶，实现罗非鱼雄性化。Chatain等[20]采用17α-甲基去氢睾丸酮投喂的方法获得了全雄性舌齿鲈。Wassermann等[21]采用雄性激素浸泡处理成功诱导尼罗罗非鱼的性反转，雄性率最高可达100%。Piferrer等[22]研究表明，提高17α-甲基睾丸酮浓度却导致银大马哈鱼雌性比例增加。

MT对中华鳖性别分化方面的影响也有报道，胡增高[23]对3种龟鳖目血浆中性激素随季节性的变化进行研究，发现中华鳖雄性个体血浆中性激素含量最低，而在交配期血浆中睾酮含量最高，说明睾酮能促进精子的形成。唐瑶[15]分别以浓度为25、50、100 mg/kg的MT投喂孵化出卵的仔稚鳖，在喂养到30 d时，稚鳖雄性特征显现。表明在性别决定前用甲基睾丸素处理可以提高仔稚鳖的雄性率。而叶玉珍等[24]以甲基睾丸素处理不同时期的中华鳖胚胎，所孵出的鳖在出生后的第1天就能观察到明显的雄性副性征，并且100%的个体外部形态发生很大改变，生殖器明显外翻，背甲稍长，尾巴粗长并露出背板的裙边。通过查阅大量文献，指出适宜浓度的MT能够促进中华鳖雄性性腺的发育，对于提高雄性率意义重大。

1.2.3芳香化酶抑制剂。在类固醇激素的代谢过程中，通常需要多种酶的参与和催化，其中一种酶称为芳香化酶(aromatase)，是体内催化雄激素转化为雌激素的关键酶，这一转化过程对鱼类、鸟类、爬行类和两栖类等脊椎动物的性别分化和性腺发育是必不可少的。芳香化酶抑制剂(AI)通过抑制芳香化酶的活性，从而抑制雌激素的合成和分泌，使胚胎内雌激素减少而雄性激素相对增加，使胚胎向雄性转化。

AI在水产动物研究中应用较广，在鱼类研究中相关报道也较多。国内李广丽等[25]采用腹部埋植方式将AI作用于2龄雌性赤点石斑鱼性腺，试验过程中鱼类卵母细胞逐渐退化，而精原细胞大量增殖，幼鱼由雌性转为雄性，成功实现性逆转，说明AI在鱼类性别分化上诱导作用明显。傅丽容等[26]研究AI对中华条颈龟性别的控制，指出在30 ℃条件下孵化受精卵，在孵化20 d时涂抹一定浓度的AI，暂养7 d后进行性别鉴定，试验组雄性率最高可达95%，而对照组雄性率最高为63%，说明AI能够有效提高中华条颈龟的雄性率。

贾一何[27]为了研究芳香化酶对乌苏里拟鲿仔鱼生理结构的影响，将不同浓度的AI饲料投喂开口2d的小仔鱼，连续投喂90 d，饲养到195日龄时观察其生长和性腺发育情况。结果表明：AI对于乌苏里拟鲿生长没有促进作用，但是能够抑制芳香化酶合成雌激素，导致雌性仔鱼卵巢内细胞排列不规则，卵细胞不能正常发育。张厚梅等[28]为了研究芳香化酶与黄鳝(monopterus albus)性逆转之间的内在联系，以不同性别黄鳝的性腺和脑组织为试验材料，采用免疫组化方法检测芳香化酶在不同性别黄鳝的性腺和脑组织上的定位及其变化趋势。结果显示：雌性黄鳝性腺中，芳香化酶主要分布在成熟卵母细胞的细胞质上，雄性黄鳝性腺中，主要分布在各级精母细胞上。分布在脑组织中的AI在黄鳝由雌性转化为雄性过程中含量逐渐减少，意味着黄鳝性腺和脑组织中的芳香化酶可能参与黄鳝的性逆转过程。

国外关于AI在鱼类性别分化方面也有报道，Piferrer等[29]以浓度为10 mg/dm3AI浸泡性别未分化的大鳞大麻哈鱼，处理2 h后发现原来具有雌性遗传基因的个体发育为雄性，且雄性性腺的形态和结构与正常雄鱼无差异。

关于AI在中华鳖研究方面，王莉等[16]采用AI在中华鳖胚胎孵化的第15期和第17期，滴加50 μg/μL的AI 5 μL，待孵化出壳后对其性腺进行染色分析，发现其性腺结构明显雄性化且雌性比例显著下调至13.1%。包海声等[30]将中华鳖受精卵在恒温恒湿培养箱中孵化至15 d时，在正对胚胎的卵壳位置上滴加20 μg/μL的AI，第2天重新滴加相同剂量的药物，置于相同环境下继续孵化，孵化至25期时收集胚胎性腺。试验结果表明，经过AI处理的中华鳖性腺内部结构发生明显变化，呈现雌性向雄性转化现象，数据统计显示，对照组中雄性稚鳖占51.0%，而AI处理组中，雄性比例显著增加到91.9%。

综合大量试验结果表明：一定浓度AI通过抑制芳香化酶的分泌，从而抑制雌性激素的合成，在生产实践中有效抑制中华鳖体内该激素的分泌对于提高雄性率意义重大。

2 中华鳖高雄性率调控技术应用

依据中华鳖高雄性率相关研究及可行性、方便操控、使用成本低的原则，不同的企业可选择相应的调控技术进行产业化生产。目前，控温控湿孵化房、控温控湿孵化箱、外源激素人工诱导法等几种措施均在生产中得到应用，而控温控湿孵化房在当前实现中华鳖高雄性率产业化应用中最普遍。

祝茜等[31]通过孵化试验表明，人工孵化比自然孵化损耗小，可以提高孵化率，大大缩短孵化时间，而调温调湿箱是最稳定和方便的孵化方式，能达到高孵化率的效果。在缺乏此设备时，因陋就简，用自制孵化盘孵化，细心管理，保持适宜的温度和湿度，也能达到较高的孵化率。林辉[32]认为鳖卵人工孵化的关键是控制孵化室的温度和湿度，室内温度控制在32～33 ℃，此时孵化箱内沙温为30～31 ℃，室内相对湿度为80%～85%。邢春英[33]对中华鳖采取控温孵化，控制恒温在30 ℃，41～42 d便会全部出壳，出壳率可达95%以上，而且稚鳖对卵黄吸收完全，体质健壮，养殖成活率相对较高。因此，在中华鳖产业化良种生产中，使用控温控湿孵化房和孵化箱，能较好地实现中华鳖高雄性率。

3 结语

动物的性别研究一直都是发育生物学和进化生物学探讨的热点话题，由于很多动物性别的可塑性，很多专家学者希望通过控制其性别来提高在某方面的利用价值。由于中华鳖个体雄性较雌性具有更高的经济价值，养殖户更加热衷于雄性的孵化和养殖。在这个研究过程中，如果能找到一种操作简便、成本低廉且高子代雄性率的诱导技术，将会大大提升中华鳖产业的发展。为此，阐述影响中华鳖雄性率的主要因子，从国内外大量研究资料中总结得出一些结论。当然，在中华鳖性别分化方面还存有未知领域，有待今后进一步探索。