草甘膦对斑马鱼生殖发育的毒性研究进展

杜太峰，郑树楷，黄苑妮，包 冕，吴库生*

( 汕头大学医学院公共卫生与预防医学教研室，广东 汕头 515041 )

草甘膦是一种广泛应用的广谱除草剂，主要针对小范围的生物体，特别是绿色植物。植物通过茎叶快速吸收使得杂草能有效根除，尤其对于一年生的阔叶杂草，因此被广泛应用于农业、园艺、森林种植等方面[1-2]。近年来，草甘膦的使用量逐渐增加，估计每年全球的需求量为50万吨[3]，喷洒、大雨冲刷、农田灌溉都直接导致了水体受到了不同程度的污染[4]。研究发现其存在于黏性土壤中的半衰期长达151 d，存在于肥沃土壤中的半衰期为10 d左右，在水体中的半衰期大约为45～60 d[5]，草甘膦半衰期的延长及降解的缓慢增加了其对生物体毒性与环境污染的风险[6]。

斑马鱼属于热带硬骨鱼，由于其产卵量大、易收集、胚胎具有光学透明性、受精率较高等优势，可清楚观察其发育的任何阶段，在毒理学研究中可方便评价毒性终点；同时，由于其与人类基因组具有87%的相似度，与人类有相似的信号传导通路，在解剖学与分子水平上均已证明与哺乳动物相似，所以斑马鱼毒性结果可大部分适用人类[7]。目前，斑马鱼已成为研究毒理学的新型毒性评价模型[8]。草甘膦等除草剂对水体的污染极为常见，对水生生物造成多种毒性影响[9]，研究其毒性作用及可能机制显得尤为重要。本文对目前草甘膦对斑马鱼造成的生殖与发育毒性研究结果作一综述。

1 生殖毒性

1.1 草甘膦对斑马鱼精子质量的影响

精子与卵细胞的质量是决定生殖能力的一项重要因素，Yousef等[10]研究表明，雄兔慢性暴露于草甘膦将导致其精子浓度降低，异常的精细胞和精细胞死亡数将增加。这可能与草甘膦直接影响精子发生和间接影响下丘脑-垂体-睾丸轴分泌激素有关。Lopes等[11]将斑马鱼暴露于草甘膦(5 、10 mg/L)24和96 h后，切除睾丸，分析精子质量，与对照组相比，暴露处理损害了精子DNA的完整性，破坏了线粒体膜的完整性及其功能，降低了精子活力，从而大大降低了斑马鱼的生殖力。Cavalli等[12]研究将大鼠暴露于草甘膦[12]，发现其繁殖力下降，可能是由于暴露诱导了支持细胞(Sertoli cells)的凋亡，从而抑制了精子发生。Clair等[13]研究表明，大鼠暴露于高剂量草甘膦(10 000 mg/L)，引起睾丸间质细胞的凋亡；暴露于低浓度(1 mg/L)时干扰了内分泌作用，表现为睾酮值下降了35%。

Uren等[14]将斑马鱼暴露于草甘膦(0.01、0.5、10 mg/L)21 d，在10 mg/L时检测到睾丸中hsd3b2、cat、sod1表达上调。草甘膦暴露影响了睾丸的类固醇激素合成，使得部分基因表达上调，从而对雄性的生殖功能产生了不利影响。

1.2 草甘膦对斑马鱼卵巢功能的影响

卵巢作为雌性动物的生殖器官，主要功能是产生卵细胞与类固醇激素，雌性斑马鱼产卵量也直接跟其生殖能力相关。Armiliato等[15]将斑马鱼卵巢体外暴露于草甘膦(65 μg/L)15 d，结果表明形态学上与对照相比无明显变化；其卵母细胞直径增加，这可能与类固醇生成因子-1(SF-1)的表达有关；同时，卵巢超微结构出现异常，发现有同心膜和髓磷脂样结构，草甘膦对卵母细胞产生的这些不利影响直接影响到其繁殖功能。

Uren等[14]将斑马鱼暴露于草甘膦，发现其卵巢中cyp19a1与ers1基 因表 达显著上调。 cy p19a1上调可能原因是，由于草甘膦暴露引起类固醇激素的机制反馈，潜在的抑制了芳香化酶的转录反应，增加了芳香酶以维持类固醇激素的比率， er s1上调是卵巢为维持雌激素通路产生一种代偿机制的结果；基因表达上调间接影响卵巢的功能，减少了产卵量。

2 发育毒性

2.1 草甘膦对斑马鱼体细胞的影响

Goulart等[16]研究将斑马鱼暴露于草甘膦(32.5、65、130 μg/L)，检测到该除草剂引起了细胞毒性，直接影响到细胞膜的完整性和线粒体的功能[17]。由于线粒体功能受到抑制作用，导致了ATP不能合成，呼吸活动减少。暴露前6 h线粒体活性下降，这是由于其自身克服除草剂引起的细胞毒性作用[18]。同时，暴露也破坏了溶酶体的功能，减少了其对机体的保护作用，更加重了细胞毒性效应。

活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是需氧细胞在代谢过程中产生的，高浓度的ROS可通过细胞氧化应激反应诱导细胞发生凋亡。Sulukan 等[19]将4 hpf(hours post fertilization)的斑马鱼暴露于草甘膦(1、5、10、100 mg/L)96 h，检测到高浓度时鳃区ROS产生增加。低剂量暴露时，产生的ROS减少或无明显改变[20]。ROS的产生可能是碳酸酐酶对二氧化碳减少产生抑制作用的结果，大量的ROS诱发了细胞凋亡，最终造成了斑马鱼多器官畸形，比如心包水肿、脊柱弯曲等。

2.2 草甘膦对斑马鱼形态学的影响

在商业杀虫剂中，草甘膦是从上世纪70年代就开始广泛应用的一种除草剂[21]。由于草甘膦应用的广泛性，研究发现其存在地表水长达60多天，对水体生物产生了潜在的毒性作用，对斑马鱼的形态损害大多发生在发育的早期阶段[4]。 Bridi等[22]将幼苗期的斑马鱼暴露于草甘膦(0、0.01、0.065、0.5 mg/L)96 h，7 dpf(days post fertilization)时观察到其体长明显缩短，暴露于高浓度(0.5 mg/L)时，其眼距也明显缩短。Zhang等[23]将4 dpf的斑马鱼暴露于草甘膦(0～400 mg/L)，浓度越高，导致其体长变短、眼睛变小、头部缩小等形态异常，当浓度达到600 mg/L时，胚胎无法存活。De等[24]将斑马鱼胚胎暴露于不同配方的除草剂(草甘膦AKB480、农达)，分别观察其24、48、72、96 h的发育毒性，发现胚胎与幼苗的存活率随着时间的增加而降低，孵化率也相应降低。

形态学的改变与相关基因的表达有着密切的关系，n t l是斑马鱼在神经胚期形成脊索的关键基因，krox20是参与脊椎动物前脑分节的一种转录因子，s h h是控制斑马鱼背中线结构表达的一个基因。Zhang等[23]研究斑马鱼(0.75 hpf)暴露于草甘膦(0、0.1、1、10、100 mg/L)，10 hpf时，与对照相比，通过原位杂交技术检测到 n tl基因表达减少，说明了脊索结构的缺陷，从而导致了其体长的缩短；13 hpf时检测到暴露对 sh h基因无明显影响，krox20的表达随着暴露浓度的增加发生了改变，扰乱了斑马鱼菱脑原节的形成与大小。

2.3 草甘膦对斑马鱼心脏发育的影响

心脏主要由心肌构成，其强有力的收缩功能满足了全身的供血，是脊椎动物的重要器官之一，影响心脏的正常发育因素有很多，有机磷农药就是其中之一。Roy等[25]研究将斑马鱼(5 hpf)暴露于草甘膦(50 μg/mL)到48 hpf，观察到其心房心室结构异常、心脏循环无规律、内脏逆位、心率降低。肌细胞增强因子-2(Mef2)对心肌细胞的调控和分化起着关键性的作用[26]，暴露后导致的心血管缺陷可能是Mef2的表达缺失以至心肌细胞异常分化的结果。Yusof等[27]发现 草 甘膦暴露导致斑马鱼心率增加，中间趋于缓和最后下降，这可能是面对应激慢慢适应环境的结果；但有研究[28]表明 草 甘膦暴露导致心动过速，可能原因是应激反应及肾上腺素增加。探究发现 草 甘膦低剂量长时间暴露导致心率加快，短时间急性暴露通常导致心率下降。

2.4 草甘膦对斑马鱼大脑发育的影响

大脑作为中枢神经中最大最复杂的结构，是调节机体功能的器官，是意识、学习、记忆、运动等高级神经活动的物质基础。研究斑马鱼大脑发育，选择5～24 h的窗口期实施暴露，在此期间斑马鱼经过了分节、体节发生、神经胚形成三个阶段，可更好的反映其大脑发育变化[29]。 乙 酰胆碱酯酶(AChE)参与了体内细胞的发育与成熟，同时具有促进神经元发育的功能。有研究发现，斑马鱼暴露于草甘膦导致了A ChE基因在大脑和肌肉表达的下调，从而影响了其正常发育[20，30]。Roy等[4]对斑马鱼(5～24 hpf)暴露于草甘膦(50 μg/mL)，观察到前脑与中脑发育缺陷、脑室轮廓的损失，后脑无发育毒性，存在前脑与中脑的基因pax2、 otx2、 pax6、 ephA4表达减少，而该基因表达与大脑发育的关联，还有待于进一步研究。

3 展望

综上所述，草甘膦及其制剂对生物性腺、心脏及大脑发育等产生了不同程度的毒性作用。目前，针对其产生的毒性作用机制还处于初级阶段，未来利用斑马鱼等模式生物开展更深入的研究，探索相关机制极为重要。另外，由于食物链的富集作用和生物放大作用，草甘膦的广泛使用对食物链顶端的生物体产生的危害逐渐引起了越来越多的人关注，因此，有必要对接触人群展开监测，对促进全民健康有着深远的意义。