粉防己碱对铜绿微囊藻的化感作用

郭孝玉，张潇月，李奇勇1， ，张丽华1， ，刘冬玲1，，林晓娟 ，王稳健,张 严1，

(1.福建省资源环境监测与可持续经营利用重点实验室,福建 三明365004；2.三明学院 资源与化工学院,福建 三明 365004)

粉防己碱对铜绿微囊藻的化感作用

郭孝玉1,2，张潇月2，李奇勇1，2，张丽华1，2，刘冬玲1，2，林晓娟2，王稳健2,张 严1，2

(1.福建省资源环境监测与可持续经营利用重点实验室,福建 三明365004；2.三明学院 资源与化工学院,福建 三明 365004)

筛选高效化感物质是生物防治水华现象研究的热点问题，为了探析防己提取的粉防己碱对铜绿微囊藻的化感作用，采用控制对比实验，设置对照和0.1、0.2、0.3和0.4 mg/L 4种粉防己碱浓度，观测铜绿微囊藻的生长动态。研究表明：粉防己碱显著抑制铜绿微囊藻生长，粉防己碱水溶液浓度越大抑藻作用越明显，最高抑制率达97%，0.40 mg/L为最佳抑藻浓度。粉防己碱为抑制蓝藻生长提供新的依据，为治理铜绿微囊藻爆发生长，提供高效环保材料和措施的新思路。

铜绿微囊藻；粉防己碱；防己；蓝藻水华；半效浓度

当前,水体富营养化已经成为全球性的环境问题,大量N、P、K等养分通过各种途径进入水体，引起水体富营养化导致蓝藻类爆发性生长[1]。蓝藻水华不仅会造成水生生物的大量死亡，还产生藻毒素和臭味污染水源，影响饮用水安全[2-3]。铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）是蓝藻水华最常见的藻种，具有很强的光合作用能力。国内外针对水体富营养化引起蓝藻爆发防治的方法主要分为物理法、化学法和生物法[4-6]。众多学者研究认为通过生物化感作用防治蓝藻水华现象，是一种高效且安全的抑藻方法,许多学者研究了水生或旱生植物的浸提取物对铜绿微囊藻生长抑制效果，取得显著成效，如芦竹、芦苇、菖蒲、荇菜、凤眼莲和睡莲提取物挺水植物[7-9]，菹草、光叶眼子菜和金鱼藻、黑藻、穗花狐尾藻等沉水植物[10-11]，也有石蒜科植物如洋葱、大葱及鲜韭菜等农作物[12]，甚至用茱萸、香加皮、苍耳子、五倍子、防己等中药材的提取物[13-16]，这些植物组织器官均对特定藻类表现出明显的化感抑制作用。

防己（Stephania tetrandra）为多年生藤本，广泛分布浙江、福建、江西等地，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒和抗高血压等效用[17]。柴民伟等（2010）研究了12种具有消炎抑菌作用中药用植物干品对蛋白核小球藻的抑制效果，发现防己水浸提物在相对浓度为1 g/L时，抑藻效应最佳[16]。防己对治理水华爆发有较好的应用前景,但防己浸提物中的化感活性物质对铜绿微囊藻细胞的作用机理仍不十分明确，尚未见报道。本研究分析粉防己碱对铜绿微囊藻化感效应，为阐明粉防己碱的化感作用机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试藻种为蓝藻门的铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)，该藻种购自中国科学院武汉淡水藻种库，将无菌环境中配置的BG-11培养基置于50 mL锥形瓶中无菌培养，光暗比为12 h∶12 h人工气候培养箱内进行培养，白天温度为25±1℃，夜晚温度为18±1℃，每天手工轻轻摇动2～4次，光照强度为2000 lx、湿度为95%[1,8,14]。观察其长到对数期再转接一次，镜检无杂藻且生长良好，作为试验藻种。供试的抑藻物质为防己提取的粉防己碱，纯度大于98%，购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 粉防己碱溶液配制

粉防己碱水溶液的配制：用电子天平（CP-214）称量得0.9 mg粉防己碱试剂，溶解于25 mL无菌容量瓶，加蒸馏水至刻度，震荡摇匀，放入温度设置为25℃，频率调为100%的超声清洗器中处理2 h使其溶于水，配制成粉防己碱水溶液相对浓度为36.0 mg/L母液。

1.3 实验步骤

（1）高温高压对BG-11溶液培养基灭菌：将BG-11溶液每20 mL移于50 mL锥形瓶中，用面塞塞住，用报纸和棉线将每个小瓶包扎好，放入高压灭菌锅灭菌，温度设为121℃，进行高温高压灭菌。

（2）铜绿微囊藻的接种：在超净台中，将所有的培养基和藻种、移液枪、烧杯、酒精灯等需要的物品用酒精消毒后，在酒精灯旁用移液枪分别向培养铜绿微囊藻的小锥形瓶中加入20 μL原处于对数生长期的藻，藻细胞初始密度均为5.0×105cells/mL。

（3）接入粉防己碱溶液：用移液枪分别向培养铜绿微囊藻的小锥形瓶中加入不同体积的粉防己碱水溶液的母液，使粉防己碱的浓度分别为0.1、0.2、0.3和0.4 mg/L 4种各3个平行样，同时对照（CK）实验样中加入等量的蒸馏水，共设置5组，将其全部放入人工气候培养箱中，按设置条件开始试验每隔24 h用血球计数板在双目显微镜下对样品进行数藻，记录观测时间日期和藻密度，连续追踪7 d。如此设置做4次重复实验。

1.4 数据处理

将铜绿微囊藻细胞计数转换为藻类密度（N/mL），采用单因素方差分析粉防己碱对铜绿微囊藻的影响，采用Student-Newman-Keuls（SNK）检验进行多重比较。藻类生长抑制率(IR)计算公式:IR(%)=(1－N/N0)×100%，其中N为处理组藻类密度，N0为同期对照组的藻类密度。通过Logit概率模型求出各浓度化感物质的半效浓度EC50,确定最佳防治铜绿微囊藻生长的剂量。实验所得数据均经SPSS2 0.0软件处理与分析。

2 结论与讨论

2.1 粉防己碱水溶液对铜绿微囊藻生长的影响

粉防己碱4种浓度与对照组（CK）分别连续观测7 d，铜绿微囊藻生长变化情况见图1：对照组（CK）和0.1 mg/L浓度的粉防己碱，藻类生长规律均为先缓慢增长到指数增长，第7天对照组的藻密度达 1.86×107cells/mL,0.1mg/L 的藻密度为 1.13×107cells/ml；但浓度为 0.2、0.3、0.4 mg/L 粉防己碱溶液对铜绿微囊藻呈现明显的抑制作用，第4天后均呈下降趋势，藻密度均低于1.9×106cells/mL，第7天藻密度在0.4～1.3×106cells/ml。从图1（B）生长抑制率来看，浓度为0.2、0.3和0.4 mg/L处理的铜绿微囊藻生长抑制率在第4天达43%～53%，第5天达73%～87%，第6天达88%以上，而0.1 mg/L处理的藻类的生长抑制率在第4天后维持在35%左右，见表1。方差齐性检验表明第1天至第3天表现为方差齐性(p＞0.248)，各组间差异不显著；而ANOVA方差分析表明防己浓度越大藻类生长抑制效果越明显，第4天不同处理组间差异显著（p＜0.05），第5天后不同组间达极显著差异（p＜0.01）。不同时期铜绿微囊藻生长的SNK多重方差比较分析表明：前3天不同组间无显著差异（p＞0.05），而第4天开始对照组CK与粉防己碱处理组有显著差异，第5天开始0.1 mg/L处理组与0.2、0.3、0.4 mg/L组间有明显差异（p＜0.05），,粉防己碱浓度越高抑藻效果越明显，但SNK检验表明0.2、0.3和0.4 mg/L 组间无显著差异（p＞0.11）。

图1 粉防己碱浓度对铜绿微囊藻生长的影响

2.2 抑制铜绿微囊藻生长的半抑制粉防己碱浓度

采用Logit模型拟合铜绿微囊藻响应粉防己碱浓度的效应（见表2），模型的Chi-Square卡方检验值为1.525（p＜0.01），得到概率为0.5时半抑制浓度（EC50）值为0.40，与分析表明该抑藻实验中粉防己碱浓度为0.40 mg/L的效果最佳。

表2 Logit模型参数估计a

2.3 分析与讨论

粉防己碱是一种有效抑制蓝藻生长的化感物质。已有研究用高效液相色谱分析法验证了防己浸提液中抑藻主要化学成分含有防己若林碱和粉防己碱，且它们均属于苄基异喹啉类生物碱，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、看菌等多方面药理作用[17-19]。铜绿微囊藻属于蓝藻门又和细菌有微妙相似点，由于蓝藻门藻的细胞核结构中无核膜核仁，细胞壁与细菌相似，属原核生物，进行有丝分裂繁殖，由肽聚糖组成，革兰染色呈阴性。Mo S,et al.(2010)报道了生物碱Hapalindole对细菌和真菌的抑制作用[20]，其抗炎杀菌的作用机理同样也可能适用于细胞结构类似细菌的铜绿微囊藻。王彩萍等（2006）研究显示微量加热法中粉防己碱对大肠杆菌有很好的抑制效果[21]，本研究也证实粉防己碱水溶液对铜绿微囊藻具有显著的生长抑制作用（见表1），其他学者研究发现防己浸提液对绿藻门中蛋白核小球藻有抑制作用的[16]。本实验第3天才观察到有细胞破裂，粉防己碱类生物碱对铜绿微囊藻渗透作用过程比较缓慢，说明化感物质对细胞器膜渗透性的影响，进而对细胞分裂、伸长和亚显微结构产生影响，使细胞内物质大量渗出，影响酶的活性降低了光合效率而导致细胞衰退。本研究模拟得到最佳半效应浓度(EC50)值为0.40 mg/L，这与其他学者研究结果一致，均在统一数量级，如李锋民等（2007）研究从大型挺水植物芦苇中分离鉴定出化感物质2-甲基乙酰乙酸乙酯，对铜绿微囊藻化感抑制作用的半效应浓度(EC50)值为0.65 mg/L[22]。防己是我国传统的中药材，为综合利用中药材达到“以废治废”，在防蓝藻爆发时通过计算水体量获得最有效浓度，在富营养水体里投放适宜量的粉防己碱母液，或在湖边栽种防己植物，利用防己分泌产生的生物碱等，通过生物化感作用从而防治蓝藻水华现象是一种有益的防治措施。

4 结论

粉防己碱水溶液对铜绿微囊藻的生长具有显著的抑制作用，浓度越高抑制效果越好，当浓度为0.4 mg/L时，第6天后铜绿微囊藻生长抑制率达94%；抑制铜绿微囊藻的最佳浓度为0.40 mg/L。

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Growth and Allelopathic Effects of Microcystis Aeruginosa under Different Concentration Tetrandrine

GUO Xiao-yu1,2,ZHANG Xiao-yue2,LI Qi-yong1,2,ZHANG Li-hua1,2,LIU Dong-ling1,2,LIN Xiao-juan2,WANG Wen-jian2,ZHANG Yan1,2
(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Resources and Environment Monitoring&Sustainable Management and Utilization,Sanming 365004,China；2.College of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China)

Biology allelopathy is an efficient and safe biological control method to prevent Cyanobacterial bloomt.In order to verify the allelopathy of tetrandrine onMicrocystis aeruginosa,we used control experiments,designed control(CK)and four tetrandrine concentration(0.1 mg/L,0.2mg/L,0.3mg/L,0.4mg/L),for cultivatingMicrocystis aeruginosaand observating consecutive seven days.The results showed that tetrandrine inhibited the growth ofMicrocystis aeruginosa.The greater the concentration,the more obvious the inhibitory effect on algae,and the inhibition rate reached up 97%.When the concentration of tetrandrine was 0.40 mg/L,it was the best concentration of suppression of Microcystis aeruginosa.The results provide a new basis for exploring the effective way to restrain Cyanobacteria growth,and provide an environmental measures to treatment ofMicrocystis aeruginosa.

Microcystis aeruginosa;tetrandrine;the root of Menispermaceae;Cyanobacterial bloom;50%effect concentration

X171.5

A

1673-4343（2017）06-0057-05

10．14098/j．cn35－1288/z．2017．06．009

2017-06-05

福建省自然科学基金项目（2014J01136）；福建省中青年教师教育科研项目（科研A类）（JA14288）；三明学院大学生创新性实验计划项目（ZL0917/CS）

郭孝玉，男，福建尤溪人，博士。主要研究方向：资源环境监测与评价。通讯作者：张严，男，广东平远人，副教授。主要研究方向：有害藻类的植物化感抑制技术。

朱联九）