超声波法夏枯草总皂苷提取工艺研究

张慧颖，肖旺钏，郑可利

(三明学院 资源与化工学院，福建 三明 365004)

超声波法夏枯草总皂苷提取工艺研究

张慧颖，肖旺钏，郑可利

(三明学院 资源与化工学院，福建 三明 365004)

目的：用超声波辅助提取夏枯草里的总皂苷，并确定出最理想的提取条件。方法：将夏枯草用乙醇浸泡后，采用超声波仪器提取其中的总皂苷，配制样品溶液后测出吸光度并且把总皂苷的含量计算出来。使用单因素实验、正交试验和平行实验验证最理想的提取步骤；结果：最理想提取条件经实验结果分析确定为超声温度40℃，乙醇浓度80%，料液比1:20，超声时间40min，提取率7.92%。结论：实验所确定的最佳条件可以提高效率，节约成本，方便操作。

超声；夏枯草；乙醇；正交试验

夏枯草（Prunella vulgaris）有许多别名，如：铁色草、棒柱头花、六月干、棒头柱等，其生长形态主要为圆柱形，颜色为棕红色或淡棕色。夏枯草生长在荒地或河岸两旁草丛、路旁、林边草地，在国内主要生长在山东、山西、浙江、广东、福建等地方省市。其中主要化学有效成分有皂苷类、三萜类、黄酮类、香豆素类、糖类和挥发油类等[1]。夏枯草的营养比较丰富，茎叶中含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、胡萝卜素、维生素B2和维生素C等成分。夏枯草味甘、微苦，具有明目、消瘀散结、清热解毒、消红肿、止疼痛的功效,可以用于治疗和预防甲状腺的肿大、乳腺的增生、高血压血脂、淋巴结核、肺结核、急性与传染性肝炎等一些临床疾病[2]。夏枯草药理活性成分里的皂苷类的化学成分具有镇静、消炎、抑菌、预防高血压、预防糖尿病、消火抗溃疡、降低血糖等多种人体生物学作用[3]。而现代药理研究也表明，夏枯草皂苷类成分有降低血压的作用，能扩张血管，降低血管通透性，降低血管脆性，降低肝脂。通过一些研究发现,皂苷类成分、三萜类中的熊果酸(UA)可以有效的预防癌症、抑制癌细胞的生成、诱导畸胎瘤细胞的分裂和抗血管生成的功能,非常有可能发展成为新一代低毒高效率的抗癌药物[4]，而皂苷类、三萜类中的齐墩果酸(OA)也具有保肝、增强免疫系统的作用[5]。

提取皂苷类物质的常用方法有很多，而超声波提取的这个方法具有操作简单、生产效率高、副产物少等优点，能达到比一般的提取方法更理想的效果，所以近年来一直被人们广泛应用于提取植物里面的皂苷[6-8]。因此，参考了类似实验研究,进行对夏枯草里的皂苷类物质的提取，对不同提取工艺条件进行多次的试验和结果比对，从中选取最理想的条件，从而有效的提高该类物质的提取率。

实验用超声波仪器辅助提取的方法提取夏枯草里的总皂苷，用紫外-可见光分光光度仪测定吸光度计算皂苷的含量[9-10]。然后比较不同的提取条件对其含量测定结果的影响，进而确定最理想提取工艺条件，为更好的开发利用皂苷类成分提供有用处的理论依据。

1 实验部分

1.1 实验原材料、试剂

原材料：夏枯草（原产地：福建）;试剂：熊果酸标准品（原产地：日本）；乙醇溶液（95%）；无水乙醇；冰醋酸；高氯酸；活性炭粉粒；香草醛（香兰素）。

1.2 皂苷含量的测定

以测定吸光度作为确定溶液中总皂苷含量的检测方法，是根据溶液中的有色物质成分的多少来判定的。皂苷类物质与较低浓度的香草醛-冰醋酸溶液加上高氯酸溶液反应会生成有一定颜色的特殊物质，在特定吸收波长里测定吸光度值就可以计算得出皂苷类物质的含量[11]，所以本实验将采用这种方法作为测定夏枯草中总皂苷含量的方法。因为熊果酸是存在于自然界里的一种具有代表性的皂苷类物质，而夏枯草的皂苷类物质又与熊果酸有相类似的化学结构，所以选择使用熊果酸作为标准对照品，在选定的吸收波长处测定样品溶液的相对应的吸光度值，计算得出从夏枯草里提取出来的总皂苷的含量。

1.3 实验过程

将购得夏枯草原材料用粉碎机进行粉碎再过420μm筛。加入一定浓度和体积的乙醇溶液，以相对应超声时间和超声温度进行超声波提取，提取液趁热马上用真空泵减压抽滤后，经过蒸发仪蒸发浓缩溶液体积、水浴加热并加入活性炭颗粒脱色、定容、显色后进行吸光度的测定，最后通过吸光度值将从夏枯草中提取出来的总皂苷的含量计算出来[12]。

1.4 提取步骤

步骤1：原料夏枯草→烘干粉碎过420 μm筛→加入配制的乙醇溶液浸泡60 min→超声波提取→立即趁热抽滤→旋转蒸发减小样品溶液体积→用20 mL无水乙醇溶解→移动至烧杯中并加入活性炭粉粒（水浴加热20 min脱色）→再次抽滤→用无水乙醇定容（50 mL）。

步骤2：从上述溶液中取1.00 mL样液至容量瓶中（10.00 mL）→水浴加热把乙醇挥发掉→加入0.20 mL的5%香草醛—冰醋酸溶液（现配）和0.80 mL的高氯酸（样品溶液显色处理步骤）→将容量瓶放入60℃水浴锅内恒温加热15 min→放置冷却至常温（约40 min）→用冰醋酸定容→按照波长使用可见分光光度计（需开机预热）测量样品中吸光度的值→根据测定值计算提取出的总皂苷含量（提取率）。

1.5 原材料的预处理

将事先购得的原材料（夏枯草）使用中药粉碎机进行粉碎，通过420 μm筛确定粉粒的大小，再至于40℃的干燥烘箱里面烘干（约120 min），最后储存在透明塑料自封袋中密封备用。

1.6 实验所用溶液的配制

熊果酸标准品溶液：称取5 mg的熊果酸标准样品，加入一些无水乙醇溶解，然后转移到50 mL容量瓶里（浓度为100 μg/mL），用无水乙醇定容，备用；

5%香草醛-冰醋酸：称取0.5g香草醛（香兰素）加到10 mL的冰醋酸里摇匀，完全溶解后备用；一系列浓度的乙醇溶液：用95%乙醇加入蒸馏水配制所得。

1.7 样品溶液的配制

使用干燥的50 mL碘量瓶准确称取1.0g夏枯草粉末，倒入20 mL浓度为70%的乙醇溶液，浸泡一个小时。设定超声温度为50℃，超声时间为40 min，进行提取，然后趁热倒入抽滤瓶中抽滤，然后转移到蒸馏瓶中，旋转蒸发干乙醇溶剂（60℃）。将20 mL左右无水乙醇倒到蒸馏瓶里面对样品进行溶解，等到样品完全溶解后将溶液转移到烧杯（50 mL）中，将烧杯置于水浴（60℃）加热并且在其中加入0.5g活性炭脱色20 min，脱色后马上趁热抽滤，把滤液倒入到50 mL容量瓶里面，使用无水乙醇定容。

1.8 确定实验测定波长

分别移取标准品溶液、样品溶液以及空白水溶液各1.0 mL到3个清洁干燥的10 mL容量瓶中。按照1.4中的步骤二配制样品溶液：往容量瓶里加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸溶液摇匀，放置到60℃水浴锅里恒温加热15 min把溶剂挥发掉，静置大约40 min冷却到常温，使用冰醋酸溶液定容，摇匀。使用开机预热好的紫外-可见分光光度计，以空白水溶液作对比，标准品溶液和样品溶液400～650 nm的波长范围内分别测定这两个溶液的吸光度值，在545 nm处得到标准品最大吸收波长，而样品溶液最大吸收波长为540 nm，经过比较加参考还是选定了540 nm为实验测定波长。

1.9 绘制标准曲线[13]

使用1 mL移液管在分别编号的6个洁净干燥的10 mL容量瓶中加入0.00、0.20、0.40、0.6、0.80、1.00 mL的标准品溶液。水浴加热挥干溶液中的乙醇溶剂，准确移取新鲜配制 5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL加入其中，置于60℃水浴恒温加热 15 min[14]，静置冷却 40 min，使用冰醋酸定容，摇匀。以加入0.00 mL标准品溶液的1号容量瓶里溶液作为空白对照，用分光光度计在540 nm波长下测定2～6号中溶液相应的吸光度值。根据移取的标准品溶液的量计算熊果酸的含量C(μg/mL)设定成横坐标,纵坐标为吸光度（A），根据测定出的吸光度值制作熊果酸标准曲线图。如图1 所示，线性回归方程：A=0.0016C-0.0011（R2=0.9995）

图1 熊果酸标准曲线

1.10 总皂苷提取率的计算公式

其中C表示将测定样品溶液吸光度值代入线性回归方程计算得出的总皂苷含量（μg/mL），M表示夏枯草粉末的质量（g）

1.11 夏枯草总皂苷提取率的4个影响因素

（1）超声温度：30、40、50、60、70℃；

（2）乙醇浓度：50%、60%、70%、80%、90%；

（3）料液比：1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30；

（4）超声时间：20、30、40、50、60min。

2 实验结果

2.1 单因素实验

2.1.1 因素超声温度与提取率

准确称取事先准备好的夏枯草粉末5份，置于干燥的50 mL碘量瓶中质量为1.0g。以1.11（1）不同的超声温度：30、40、50、60、70℃的为变化的条件因素，以乙醇浓度 70%，料液比 1∶20，超声时间40 min为不变的条件因素按1.4中的两个步骤进行总皂苷的提取，按步骤测定样品的吸光度，并计算出提取率，从图2中观察超声温度的对提取率的影响情况。

观察图2可以得到，在超声温度为50℃时提取率出现了最大值，在50℃之前提取率随温度的升高表现为增长，但是之后随着温度的提高提取率反而出现了小幅度的减小。因为皂苷易溶于温度高的乙醇溶液，所以温度越高皂苷越容易溶出，但是温度过高会使乙醇挥发速度加快，乙醇溶剂的量减少了相应的皂苷的溶出量也会减小，最终导致提取率降低。因此最理想的超声温度应该为50℃。

2.1.2 因素乙醇浓度与提取率

称取5份1.0g夏枯草粉末置于干燥的碘量瓶中,用1.11（2）不同乙醇浓度：50%、60%、70%、80%、90%，然后设定相同的超声温度50℃，料液比1∶20，超声时间40 min按照1.4中的两个步骤进行总皂苷的提取，对样品溶液进行吸光度数值的测定，再根据测定出的数值计算出皂苷的提取率，结果如图3所示。

图2 超声温度与提取率的关系曲线

图3 乙醇浓度与提取率的关系曲线

从图3中可以看得出，并非乙醇浓度越高提取率越高，提取率是随着乙醇浓度的提升先出现了增长后来又减小了，当乙醇浓度为80%，提取率出现最大值。可能是由于极性的影响，乙醇溶液的极性随着浓度增大而降低，当乙醇浓度为80%乙醇溶液极性和皂苷的极性相近，皂苷在乙醇溶液中的溶解度最大。所以最佳乙醇浓度应为80%。

2.1.3 因素料液比与提取率

称取5份质量为1.0g夏枯草粉末置于洁净干燥的50 mL碘量瓶中，以1.11（3）不同的料液比：1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 为变量，设定相同的超声温度 50℃，超声时间 40 min，乙醇浓度 70%的情况下对皂苷进行超声提取（按1.4中的步骤），测定样品的吸光度数值，分别代入方程计算提取率，变化情况如图4所示。

从图4可以观察到，料液比越高提取率也越高，但是在料液比为1∶20之前变化趋势比较大，而料液比为1∶20之后没有过多的增长变化趋势趋于平缓，没有明显的增长。可能是因为夏枯草中的总皂苷已经大部分析出溶解在乙醇溶剂中，加入再多的溶剂也不会使总皂苷的含量出现大幅增长。所以为了防止试剂的浪费，应以1∶20为最理想的料液比条件。

2.1.4 因素超声时间与提取率

使用干燥的碘量瓶称取 5份 1.0 g夏枯草粉末，以 1.11（4）不同的超声时间：20、30、40、50、60 min作为变量，在设定相同的超声温度50℃、料液比1∶20、乙醇浓度70%的情况条件下，对样品中的总皂苷进行提取（按1.4中的步骤）。根据测定的吸光度，分别计算提取率，再绘制曲线图。皂苷提取率的变化趋势如图5所示。

图4 料液比与提取率的关系曲线

图5 超声时间与提取率的关系曲线

由图5可以得出，超声时间为30 min时夏枯草总皂苷有最高提取率，但是时间一过30 min提取率开始大幅度的减小。一方面可能是时间过长导致夏枯草中的其它成分在溶剂中的溶解，造成溶剂中的溶质增多，影响了皂苷的溶出，另一方面可能因为长时间超声及加热使皂苷发生分解，在溶剂中的溶解度随之降低。从提取出的皂苷质量的高低和节约实验时间两方面进行考虑，选择30 min作为实验超声时间应该是最为理想的。

3 分析与讨论

3.1 正交试验[15]

3.1.1 实验因素和水平

为了确定从夏枯草里提取总皂苷的最理想的条件，以单因素实验中4个会影响结果的因素：超声温度A、乙醇浓度B、料液比C、超声时间D，根据2.1单因素实验的结果，从每个因素中选取3个水平。评定标准：从夏枯草里提取总皂苷的提取率的高低，以L9(34)正交表（表1）进行正交试验部分的实验操作。

表1 提取皂苷的正交因素水平表

3.1.2 正交试验结果

正交试验结果见表2。

表2 提取皂苷的正交试验表L9(34)

3.1.3 结果分析

根据正交试验表（表2）中4个极差数值大小的比较，可以得出因素对夏枯草总皂苷的提取影响程度的大小排列顺序为B＞C＞A＞D，也就是说乙醇浓度B是影响夏枯草中的总皂苷提取率最重要的因素，料液比与超声温度影响程度次之，而超声时间对提取率的影响程度最小。对正交试验的结果分析得出超声温度40℃，乙醇浓度80%，料液比1∶20，超声时间40 min为提取夏枯草里总皂苷成分最佳工艺条件。

3.1.4 最佳工艺条件平行实验

准确称取3份1.0g夏枯草粉末置于干燥的碘量瓶中，利用3.1.3中分析得到的最佳组合条件（超声温度40℃、乙醇浓度80%、料液比1∶20、超声时间40 min），进行提取总皂苷平行实验，测量出吸光度的数值并且计算得出3份平行样品的提取率分别为7.92%、7.91%、7.92%，平均提取率为7.92%，7.92%的提取率比3.1.2正交试验表中的较优组合2的提取率7.88%高出0.04%，所以可以确定分析结果后选出的最佳提取条件是与平行实验的结果相符合的。

3.2 讨论

分析上面单因素实验与正交试验的最终结果可以得到，选择浓度为80%的乙醇溶液作为从夏枯草里总皂苷的提取溶剂，提取效果是最理想的。皂苷是一种有机物质，据有比较大的极性，乙醇溶液的极性是随着浓度的变化而变化的。根据常用的相似相溶这个物理性质[16]，当溶剂和溶质极性相接近的时候，溶质在溶剂中的溶解程度会增大。乙醇在浓度为80%时候的极性与皂苷的极性比较接近，所以浓度为80%时乙醇溶剂中皂苷的含量是最高的。并且使用乙醇作为溶剂可以进行回收再次的利用，回收利用处理的方法也相对比较简单，所以选用了80%的乙醇溶液作为总皂苷的提取剂。

根据上面的正交试验的结果分析，可以得出这4个因素对夏枯草中总皂苷提取率的影响程度大小排序是:乙醇浓度B＞料液比C＞超声温度A＞超声时间D。选择超声温度40℃、乙醇浓度80%、料液比1∶20、超声时间40 min作为提取夏枯草中总皂苷的最理想最好的提取条件，计算得到了最佳提取率为7.92%。

3.3 结论

实验选择使用超声波法辅助提取夏枯草里的总皂苷与传统的醇溶剂浸提法相比，具有操作时间明显缩短、提取温度低、提取率高、提取物结构不会被破坏等特点[17]。可以做到降低提取成本，提高提取效率，节省提取能源，为更好开发和利用夏枯草中皂苷类的有效成分提供了一定的参考价值。

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Ultrasonic Assisted Extraction of Total Saponins from Prunella Vulgaris

ZHANG Hui-ying，XIAO Wang-chuan，ZHENG Ke-li

(School of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China)

Objective:Total saponins were extracted form prunella by ultrasonic assisted process and the optimun parameters were determined.Methods:Ultrasonic extraction was conducted by thePrunella vulgarissoaked in ethanol and the concentration of saponins was calculated from the absorbance.The optimum conditions were obtained from the single factor experiment,orthogonal and parallel experiments.Results:The highest yield of 7.92%saponins was resulted from the ultrasonic temperature 40℃,ethanol concentration 80%,solid-liquid ratio 1:20,ultrasonic time 40min;Conclusion:The optimum conditions are of advantages such as high efficiency,cost saving and convenient operation.

ultrasonic;Prunella vulgaris;ethanol;orthogonal test

R284.2

A

1673-4343（2017）06-0050-07

10．14098/j．cn35－1288/z．2017．06．008

2013-09-17

大学生创新创业项目（ZL1222/CS(sj),SD1111，STS0801）

张慧颖，女，福建闽侯人，大学生。主要研究方向：天然产物提取与分离。通讯作者：郑可利，男，福建永泰人，教授。主要研究方向：天然产物提取与分离。

朱联九）