纤维素酶解复合碱提酸沉法提取杏鲍菇蛋白质*

史瑞婕，郭丰铭，冯翠萍

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801）

纤维素酶解复合碱提酸沉法提取杏鲍菇蛋白质*

史瑞婕，郭丰铭，冯翠萍**

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801）

为提高杏鲍菇（Pleurotus eryngii）蛋白质的提取率，本试验采用纤维素酶解复合碱提酸沉法进行提取，以料液比、酶的添加量、反应时间和温度为因素进行单因素试验，蛋白质提取率为响应值，利用Box-Behnken进行响应面优化纤维素酶解条件，与单一碱提酸沉法提取蛋白质后的提取率进行比较。试验结果表明，纤维素酶解最佳工艺条件为：料液比1:55，温度40℃，时间100 min，酶的添加量1.5%，复合碱提酸沉后蛋白质提取率为51.36%，显著高于碱提酸沉法的45.89%。因此，纤维素酶复合碱提酸沉法提取杏鲍菇蛋白质优于碱提酸沉法。

杏鲍菇；蛋白质；酶解复合碱提酸沉法；碱提酸沉法

杏鲍菇（Pleurotus eryngii），又称刺芹木耳，隶属于真菌门（Eumycota） 真担子菌纲（Eubasidiomycetes） 伞菌目 （Agaricales） 侧耳属 （Pleurotus），有“菇中之王”的美称，是药食同源的珍稀食用菌[1-4]。杏鲍菇富含蛋白质、碳水化合物、矿物质、维生素和多种矿物质，其中蛋白质含量为12.4%～35%[5-8]，具有抗氧化和免疫活性调节等功能[9]，为优质蛋白质来源的食物。目前，蛋白质的提取工艺有传统的碱

提酸沉法[10-11]、盐溶法等[12-13]，本课题组前期研究表明，碱提酸沉法提取杏鲍菇蛋白质提取率可达45%左右[14]。对于杏鲍菇而言，其菌体细胞壁含有大量的纤维素，可通过纤维素酶的作用来破坏细胞壁，从而达到释放蛋白质的目的，提高蛋白质的提取率，因此本试验选择纤维素酶解复合碱提酸沉法提取杏鲍菇蛋白质，并进行工艺优化，以期为杏鲍菇蛋白质工业生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

杏鲍菇粉，山西农业大学食用菌中心提供；氢氧化钠、盐酸、氯化钠、无水乙醇、磷酸，均为国产分析纯；纤维素酶，酶活力≥1.0×104U·g-1，国药集团化学试剂有限公司；牛血清蛋白质标准品，上海哈灵生物科技有限公司；考马斯亮兰G-250染料试剂，上海源叶生物科技有限公司。

1.1.2 主要仪器与设备

HHS-21-4型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TDL-4台式离心机，湘仪离心机厂；PHS-3C型精密pH计，上海虹益仪器仪表有限公司；BS224S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；JDG-0.2型冷冻干燥机，兰州科技真空冻干技术有限公司；高速冷冻离心机，Sigma公司；UV-2102C型紫外/可见分光光度计，上海美析仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 纤维素酶解复合碱提酸沉法提取杏鲍菇蛋白质

称取一定量的杏鲍菇蛋白粉，按一定液料比加入蒸馏水，同时加入一定比例纤维素酶（以原料干粉计）并充分搅拌，在一定温度下恒温振荡反应一定时间，结束后在80℃水浴中进行钝化酶处理。放置常温后，调节pH到12，55℃反应2.5 h，之后在4 000 r·min-1离心15 min，取上清液，沉淀重复上述操作进行复提，合并2次上清液。用0.1 mol·L-1的HCl调节pH到杏鲍菇蛋白质等电点3.6，静止1 h，在4 000 r·min-1的条件下离心10 min，得到蛋白质沉淀，加蒸馏水溶解，用0.01 mol·L-1的NaOH调节pH到7.0，得到杏鲍菇蛋白质提取液，测定总蛋白含量，浓缩后进行透析除盐，然后进行冷冻干燥，得到杏鲍菇蛋白粉。

1.2.2 纤维素酶解复合碱提酸沉法最佳工艺条件的确定

（1）不同酶解条件对杏鲍菇蛋白质提取率的影响

料液比：在酶添加量2.0%，作用时间90 min，温度 40℃的条件下，设置料液比为 1∶40、1∶45、1∶50、1∶55和1∶60，之后进行钝化酶处理，放置常温后，再用碱提酸沉提取杏鲍菇蛋白质，考察料液比对杏鲍菇蛋白质提取率的影响。

酶添加量：在料液比1:55，酶作用时间90 min，温度40℃的条件下，设置酶添加量为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，之后进行钝化酶处理，放置常温后，再用碱提酸沉提取杏鲍菇蛋白质，考察酶添加量对杏鲍菇蛋白质提取率的影响。

酶作用时间：在料液比1:55，酶添加量2.0%，温度40℃的条件下，设置酶作用时间为60 min、90 min、120 min、150 min和180 min，之后进行钝化酶处理，放置常温后，再用碱提酸沉提取杏鲍菇蛋白质，考察酶作用时间对杏鲍菇蛋白质提取率的影响。

温度：在料液比1:55，酶添加量2.0%，酶作用时间90 min的条件下，设置温度为30℃、40℃、50℃、60℃和70℃，之后进行钝化酶处理，放置常温后，再用碱提酸沉提取杏鲍菇蛋白质，考察温度对杏鲍菇蛋白质提取率的影响。

（2）响应面优化试验

在单因素试验的基础上，进行4因素3水平Box-Behnken试验设计，以杏鲍菇蛋白质提取率作为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行分析，得出纤维素酶解杏鲍菇的最佳工艺条件。

1.2.3 碱提酸沉法提取杏鲍菇蛋白质

根据参考文献[14]，称取一定量的杏鲍菇粉，按料液比为1:55加入蒸馏水，并调节pH到12，于50℃条件下提取2.5 h。然后在4 000 r·min-1离心15 min，取上清液，沉淀重复上述操作进行复提，合并2次上清液。用0.1 mol·L-1的HCl调节pH到杏鲍菇蛋白质等电点3.6，静止1 h，在4 000 r·min-1的条件下离心10 min，得到蛋白质沉淀，加蒸馏水溶解，用0.01 mol·L-1的NaOH调节pH至7.0，得到杏鲍菇蛋白质提取液，测定总蛋白含量，然后进行冷冻干燥，得到杏鲍菇蛋白粉。

1.2.4 蛋白质的测定

（1） 试剂配制

考纳斯亮蓝G-250染液：称取0.1 g的G-250粉末，溶解到50 mL质量浓度为90%的乙醇中，同时加入100 mL质量浓度为85%的磷酸，定容到1 L，得到G-250染液。

标准牛血清蛋白溶液：准确称取标准牛血清蛋白7.5 mg，并溶于50 mL水中，混匀，配制成质量浓度为0.15 g·L-1的标准牛血清蛋白溶液，待用[15]。

（2） 绘制标准曲线

准确吸取配制好的标准蛋白溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于试管中，再分别加入水 1.0 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.4 mL、0.2 mL、0，摇匀后，分别加入5 mL的考马斯亮蓝G-250染液，室温下反应2 min，在波长为595 nm的条件下测定其吸光度值A595，以标准蛋白量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。得出线性方程为：

式中：C为蛋白质的质量浓度，g·L-1；A595为吸光度值；R2=0.9949。

（3）蛋白含量的测定

准确吸取待测蛋白溶液1 mL于试管中，加入5 mL的考马斯亮蓝G-250染液，摇匀后，在室温下反应2 min，在1.2.4（1） 相同条件下测定其吸光度值A595，根据标准曲线计算待测样品中蛋白含量（g）。

（4）蛋白质提取率的计算

蛋白质提取率（P）公式为：

式中：m1表示提取液中蛋白质含量，g；m2表示杏鲍菇粉重。

1.3 数据处理

纤维素酶解复合碱提酸沉法提取杏鲍菇蛋白质的响应面优化试验，利用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行分析，数据结果以 x±S表示，同时利用SPSS软件进行显著分析，检验水平α为0.05。

2 结果与分析

2.1 不同酶解条件对杏鲍菇蛋白质提取率的影响

不同酶解条件对杏鲍菇蛋白质提取率的影响见图1。

图1 不同酶解条件对杏鲍菇蛋白质提取率的影响Fig.1 Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on the extraction ratio of Pleurotus eryngii protein

从图1A中可知，随着料液比的增大，蛋白质的提取率呈先上升后下降的趋势，这可能是因为料液比较低时，水分含量低时纤维素酶与底物反应不充分，降低蛋白质提取率，当料液比增大时，水分含量增大到一定程度时使纤维素酶与底物结合不充分，导致催化作用率降低，蛋白质提取率下降[16]；图1B中表明了随着温度的提高，蛋白质的提取率呈先升高后下降的趋势，可能是因为低温时有利于纤维素酶与底物的结合，使得催化作用加强，蛋白质提取率增大，而高温时，纤维素酶的活性降低，催化作用降低，导致蛋白质提取率增大；图1C表明了随着酶作用时间的延长，蛋白质的提取率呈现升高后降低的趋势，可能是由于在一定的反应时间内，纤维素酶与底物结合速率快，催化效率高，使得蛋白质提取率增大，随着反应时间的延长，因为底物量和酶量一定，其结合速率下降，导致蛋白质提取率下降[17]；图1D表明了随着酶量的增加，蛋白质提取率呈先增大后平衡的趋势，可能是因为在第一阶段酶作用于底物速度快，使细胞内容物尽快释放出来，促使蛋白质提取率增大，随着酶量的增大，因为此时底物量一定，酶量过多导致酶与底物结合率降低，从而使的蛋白质提取率下降[18]。

2.2 响应面试验结果与分析

Box-Behnken试验设计与结果见表1。

表1 Box-Behnken试验设计与结果Tab.1 Experimental design and results of Box-Behnken

以料液比（A）、纤维素酶添加量（B）、反应时间（C）、反应温度（D）为关键工艺参数，蛋白质提取率（%）为指标，根据表格1中的试验成果，运用Design-Expert 7.0软件进行验证，同时并除去不显著项，得出操作参数对提取率的回归方程为：蛋白质提取率（%）=59.94＋3.27×A＋5.14×B-0.054×C-2.53×D＋0.26×A×B＋0.83×A×C＋1.59×A×D-3.12×B×C-4.04×B×D-3.13×C×D-6.64×A2-3.07×B2-3.95×C2-6.36×D2。蛋白质提取率多项式模型的方差分析见表2。

通过进一步对杏鲍菇蛋白质提取率回归模型以及各项系数进行方差显著性分析，由表2可以得出，其 F=12.30，F （Prob＞F） ＜0.1000，得出杏鲍菇蛋白质提取率的模型极显著，且回归方程的确定系数为R2=0.9513，表明了该模型的拟合程度比较好。该模型中单因素项A、B与D极显著，C不显著；交互作用BC、BD与CD极显著；二次项A2、B2、C2与D2均极显著。纤维素酶解复合碱提酸沉法提取杏鲍菇蛋白质响应面分析见图2。

图2更加直观地表明了BC、BD和CD之间交互作用对杏鲍菇蛋白质提取率的影响。图2A表示在料液比和温度一定时，随着时间和酶量增加，蛋白质提取率增大，当时间大于150 min，酶量大于2.0%时，蛋白质提取率几乎不变；图2B表明在料液比和时间一定时，随着酶量和温度的增大，蛋白质提取率增大，加酶量大于2.0%，温度大于45℃时，蛋白质提取率降低；图2C表明了料液比和酶量确定时，随着温度和时间增加，蛋白质提取率增大，当时间大于150 min，温度高于45℃，蛋白质提取率下降。

2.3 碱提酸沉法与纤维素酶解复合碱提酸沉法蛋白质提取率比较

利用碱提酸沉法提取杏鲍菇蛋白质，所得的杏

鲍菇蛋白质提取率为（45.89±0.21）%，利用纤维素酶解复合碱提酸沉法进行提取，所得杏鲍菇蛋白质提取率为（51.36±0.16） %，进行显著性分析后，得出在P＜0.05水平上存在显著差异。

表2 蛋白质提取率多项式模型的方差分析表Tab.2 Variance analysis table on polynomial model of protein extraction rate

图2 纤维素酶解复合碱提酸沉法提取杏鲍菇蛋白质响应面Fig.2 Response surface plots showing the effects of interactions of Pleurotus eryngii protein

3 结论

纤维素酶解杏鲍菇的最佳工艺条件为：料液比1:55，温度40℃，时间100 min，酶的添加量1.5%，在该工艺条件下复合碱提酸沉法提取杏鲍菇蛋白质，其提取率达到51.36%，显著高于单一碱提酸沉法的45.89%。

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Extracting Pleurotus eryngii Protein by Combining Cellulose Enzymatic Hydrolysis and Acid Precipitation After Alkaline Extraction

SHI Rui-jie,GUO Feng-ming,FENG Cui-ping
(College of Food Science and Engineering,Shanxi Agriculutural University,Taigu 030801,China)

To improve the extraction rate of Pleurotus eryngii protein,the method of combining cellulose enzymatic hydrolysis and acid precipitation after alkaline extraction was used.The single factor test was carried out with the ratio of material to liquid,enzyme addition,reaction time and temperature as the factors,and Box-Behnken design was used to establish the optional hydrolysis conditions with the protein extraction rate as the response value.It was also compared with the extraction rate of alkaline extraction and acid precipitation.The results showed that the best extraction condition of cellulose enzymatic hydrolysis were as follows:material to liquid(m·v-1)1:55,enzyme addition 1.5%,reaction time 100 min and temperature 40℃.The extraction rate of combining cellulose enzymatic hydrolysis and acid precipitation after alkaline extraction was 51.36%,which was significantly higher than that of acid precipitation after alkaline extraction.So extracting P.eryngii protein by combining cellulose enzymatic hydrolysis and acid precipitation after alkaline extraction was better than the acid precipitation after alkaline extraction.

Pleurotus eryngii;protein;combining enzymatic hydrolysis and acid precipitation after alkaline extraction;alkaline extraction and acid precipitation

S646.1

A

1003-8310（2017）06-0058-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.06.013

山西省重点研发计划（重点）项目（201603D211201）；山西省煤基重点科技攻关项目（FT2014-03-01）；山西省黄土高原食用菌提质增效协同创新中心资助。

史瑞婕（1993-），女，在读硕士研究生，主要研究方向为食品营养与安全。E-mail:srj0505＠163.com

**通信作者：冯翠萍（1970-），女，博士，教授，主要从事食品营养与安全。E-mail:ndfcp＠163.com

2017-09-22