超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查水产品中28种农药类环境激素

鞠玲燕，李兆杰*,王 骏，徐成钢，崔 嘉

(1.威海出入境检验检疫局，山东 威海 264200； 2.山东出入境检验检疫局，山东 青岛 266001)

超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查水产品中28种农药类环境激素

鞠玲燕1，李兆杰1*,王 骏2，徐成钢1，崔 嘉1

(1.威海出入境检验检疫局，山东 威海 264200； 2.山东出入境检验检疫局，山东 青岛 266001)

建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查和分析水产品中28种农药类环境激素的方法。样品经乙酸乙酯提取，Captiva ND Lipids小柱净化，用Acquity UPLC@BEN C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)分离，以甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。采用正、负离子切换同时测定了28种农药类环境激素，大大提高了检测通量。以全扫描模式下提取的保留时间和一级母离子精确质量数以及同位素丰度比，实现对水产品中多种农药类环境激素的快速筛查；以自动触发采集的二级碎片离子精确质量数进行确证。结果表明，目标化合物的线性关系良好，相关系数(r2)大于0.99；除乙草胺、腐霉利和杀螟硫磷外，其他化合物的检出限不大于10 μg/kg，回收率为65.7%～98.9%，相对标准偏差为6.2%～11.3%。该方法简单、准确、快速、可靠，适用于水产品中多种农药类环境激素的高通量快速定性筛查和定量分析。

超高效液相色谱；静电场轨道阱高分辨质谱；农药；环境激素；快速筛查

环境激素是指干扰动物和人体正常内分泌机能的外源性化学物质，此类物质具有环境毒性与类似雌激素的作用，故又称环境雌激素或环境内分泌干扰物，其在环境中不易降解，易通过食物链在生态系统内富集，具有致癌、致畸、致突变等作用[1-2]。欧盟、美国、日本等国家和地区早在20世纪90年代就启动环境激素的系统研究，目前已识别的环境激素中农药类约占一半，农药类环境激素是环境激素中的最大类别。我国是农业大国，也是农药生产和使用大国，面临着严峻的环境激素类农药污染危害。目前，世界各国均已建立农药优先名录，加强对环境激素类农药的监控[3-4]。

目前，针对农药类环境激素的检测方法主要有气相色谱法[5-7]、气相色谱-质谱联用法[8-10]、液相色谱-质谱联用法[11-14]。而这些方法在检测分析中存在以下问题：对复杂基质的抗干扰能力不足，常出现假阳性；无法同时在正负离子模式下检测多种农药类环境激素，故检测化合物种类有限；方法参数的优化费时费力[15]。而高分辨质谱(Orbitrap)具有较强的抗干扰能力和高通量，在简化前处理过程的同时，极大地扩展了检测化合物的数量，可以同时对多种类别农药类环境激素进行快速筛查检测。

本研究选择欧盟、日本和我国环境激素优先名录中28种农药为研究对象，建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法同时测定水产品中多种农药类环境激素的快速筛查和定量分析方法。方法采用Q-Exactive的正负离子全扫描模式获得一级数据，通过提取目标化合物的一级质谱精确质量数获得定性和定量结果，通过自动触发获得的二级全扫描数据进一步提高定性的准确性。该方法快捷、方便、高通量，可用于水产品中多种农药类环境激素的快速筛查和确证。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪Q-Exactive(美国Thermo Fisher公司); CR22GⅡ高速冷冻离心机(日立公司)；Buchi旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)。

标准品：除利谷隆、溴苯腈、土菌灵、涕灭威、甲萘威购自德国Dr.Ehrenstorfer公司外，其余标准品均购自农业部环境保护科研监测所。甲醇(色谱纯，美国默克公司)；乙酸乙酯(色谱纯，德国 CNW 公司)。Captiva ND Lipids小柱(美国Agilent公司)为3 mL无滴落小柱，采用标准的SPE柱样式，具有0.2 μm的过滤孔径，填充料为聚偏氟乙烯和聚丙烯，可与甲醇或乙腈使用，双层过滤介质设计确保了流量一致，同时避免了过滤器堵塞，能够有效消除蛋白、颗粒物以及样品中的离子抑制磷脂。

1.2 色谱质谱条件

1.2.1色谱条件色谱柱：Acquity UPLC@BEN C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；流速：0.2 mL/min；柱温：室温；进样体积：10 μL；流动相：A为甲醇，B为0.1%甲酸水。梯度洗脱程序：0～2 min，10% A；2～8 min,10%～95%A；8～12 min，95%A；12～12.1 min,95%～10%A;12.1～15 min，10%A，分析时间：15 min。

1.2.2质谱条件喷雾电压：正离子模式3 kV，负离子模式2.8 kV；离子源温度：300 ℃；传输金属毛细管温度：320 ℃；鞘气压力：30 arb；辅助气压力：10 arb；扫描范围(m/z)：50～500 Da；一级质谱全扫描(Full scan)分辨率：R=70 000；AGC target：3e6；最大注入时间：100 ms；数据依赖二级离子全扫描(FullMS/ddMS2)分辨率：R=17 500；(N)CE/stepped nce:20、40、60 eV；AGC target：2e5；最大注入时间：50 ms；动态排除：10 s。

1.3 样品前处理

准确称取5.00 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL乙酸乙酯，涡旋，超声提取15 min，4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min，将上层乙酸乙酯层转入旋转蒸发瓶中，剩余残渣再加入20 mL乙酸乙酯，重复提取1次，合并乙酸乙酯层清液，40 ℃旋转浓缩至干。准确加入1.0 mL甲醇-水(8∶2)涡旋30 s，溶解残渣，过Captiva ND Lipids小柱，收集液体，上机检测。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

2.1.1提取溶剂的选择本研究待测的农药类环境激素种类较多，需兼顾各类目标检测物的提取效率。实验考察了正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈4种提取溶剂的提取效果，发现乙酸乙酯和乙腈提取的回收率均在80%以上，但乙腈提取液易吸附水分，旋蒸慢且不彻底。而乙酸乙酯提取液干净、杂质少，易于旋蒸。因此选择乙酸乙酯作为提取溶剂。

2.1.2净化方式的选择水产品中含有较多的脂肪酸和一定的油脂。实验比较了HLB固相萃取柱、Florisil硅土固相萃取柱和Captiva ND Lipids小柱的净化效果。发现Captiva ND Lipids小柱可有效去除脂类、蛋白等基质干扰，净化效果最好，回收率在80%以上，且无需活化洗脱程序，净化方法简便、快捷，因此选择该柱进行样品净化。

2.2 色谱条件的优化

考察了Acquity UPLC@BEN C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)超高效色谱柱和普通的C18色谱柱对待测物的分析效果。结果表明，前者能够为待测物提供尖锐对称的色谱峰形，具有更高的柱效和检测灵敏度。同时，考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水4种流动相对分析结果的影响。结果表明，有机相采用甲醇的分离结果和信号强度优于乙腈，这可能是由于前者更易于挥发和离子化；而且当流动相中加入0.1%甲酸后，可以提高待测物质的信号强度，故采用甲醇-0.1%甲酸水作为流动相。由于不同类环境激素性质有差别，为实现有效分离，经反复优化，确定了“1.2.1”所述的流动相梯度洗脱条件，28种环境激素可在15 min内获得较好的分离效果和较理想的峰形。

2.3 质谱条件的优化

本研究采用高分辨质谱的一级质谱全扫描和数据依赖的二级质谱扫描方式，对目标检测物进行定性筛查和确证。考虑到不同目标待测物的性质各异，一级质谱全扫描采用正负离子切换扫描的方式来提高检测通量，通过全扫描确定目标化合物的精确质量数和保留时间(表1)。使用高分辨质谱检测目标化合物的精确质量数对于同时准确定性和定量非常重要，因此必须保证质谱数据具有良好的质量准确度。表1列出的28种环境激素的质量准确度误差均小于5 ppm，可见检测物的质量准确度均很好，可以满足定性需求。

表1 28种环境激素的精确质量数、保留时间及质量准确度误差Table 1 Accurate masses,retention times and mass accuracy error of the 28 environmental endocrine disrupting pesticides

高分辨质谱最大的优势是通过高分辨率消除样品中的基质干扰，提高定性和定量结果的准确性。研究发现，当一级全扫描采用分辨率R=70 000，所有待测物可与基质干扰物实现基线分离。图1为28种环境激素的提取离子色谱图。

图1 28种农药类环境激素的提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms of 28 environmental endocrine disrupting pesticides

根据获得的精确质量数设定目标物列表，仅在一级质谱扫描时发现列表中的母离子，且其强度达到设定阀值时，可自动采集二级质谱扫描。碰撞能量设为40 eV，并在此基础上加减50%，即有3个碰撞能量对目标物进行碰撞，最终加和获得丰富的碎片离子(表2)。因此，分析结果既有母离子的精确质量数，又有二级质谱全扫描的碎片离子信息，提高了定性的准确性，对于同分异构体(如甲草胺和乙草胺、扑草净和特丁净)，二者保留时间虽基本一致，但可通过不同的碎片离子信息进行定性筛查。高分辨质谱除保留时间上无法区分的同分异构体需借助二级碎片离子定量外，其余化合物均以母离子作为定量离子，且直接采用梯度设置碰撞能，大大简化了质谱参数的优化，节省了样品分析前的准备时间，更利于样品的快速筛查和定量分析。

表2 28种农药类环境激素的碎片离子信息Table 2 Fragment ions of the 28 environmental endocrine disrupting pesticides

2.4 方法学验证

2.4.1方法的线性范围与检出限用不含待测物的空白基质溶液配制一系列标准样品，经高分辨质谱测定，以色谱峰面积(Y)为纵坐标，对照溶液的质量浓度(X, μg/kg)为横坐标绘制标准曲线。采用向空白样品中逐级降低加标浓度的方法确定检出限(LOD)，加标样品按“1.3”方法处理并上机检测，以仪器所能检出的最低加标浓度确定为方法的检出限。结果表明，28种环境激素在相应浓度范围内呈良好的线性关系，大部分化合物的检出限在0.5～10 μg/kg范围内，可满足检测要求(表3)。

表3 28种环境激素的相关系数、线性范围和检出限Table 3 Correlation coefficients,linear range and LODs of 28 environmental hormones

(续表3)

No CompoundCorrelationcoefficient(r2)Linearrange(μg/kg)LODs(μg/kg)No．CompoundCorrelationcoefficient(r2)Linearrange(μg/kg)LOD(μg/kg)5Carbaryl0 999910～10001019Triadimefon0 99915～5005 06Procymidone0 9989100～1000010020Propanil0 999220～1000107Fenitrothion0 999720～20002021Dipterex0 99911～1001 08Metribuzin0 99941 0～1001 022Triadimenol0 999910-1000109Prometryn0 99960 5～1000 523Diazinon0 99901～1001 010Terbutryn0 99971～1000 524Etrdiazole0 99945～5005 011Simazine0 99941～1001 0252，4⁃D0 999810～10001012Malathion0 99985～5005 026Bromoxynil0 99842～1002 013Methomyl0 998510～10001027Dichlorophenol0 99882～1002 014Aldicarb0 999110～10001028Pentachlorophenol0 99920 5～1000 5

2.4.2回收率及精密度选取不同基质(鱼肉、虾肉)的空白样品，分别添加3个不同浓度水平的混合标准溶液，按“1.3”方法进行前处理，每个水平重复测定6次，计算其回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表4。测定的平均回收率为65.7%～98.9%，RSD为6.2%～11.3%。该方法具有较好的回收率和重复性，可满足水产品中28种农药类环境激素日常监测的要求。

表4 鱼肉和虾肉中28种环境激素的平均回收率和相对标准偏差(n=6)Table 4 Average recovery and the relative standard deviation of 28 environmental hormones in fish and shrimp(n=6)

2.5 实际样品的检测

采用本文建立的方法对20份鱼肉、5份虾肉、10份蛤肉和10份海带样品进行测定，其中1份蛤肉样品和1份海带样品中筛查出扑草净残留，含量分别为10.8 μg/kg和38.2 μg/kg。

以蛤肉中检出扑草净为例，介绍实际样品中化合物的筛查和确证过程。首先，对样品进行FullMS/ddMS2检测，将检测数据通过Trace Finder的定性筛查软件与标准溶液的保留时间、母离子精确质量数、同位素丰度以及二级碎片离子进行比对，进行快速筛查和确证；同时，通过Trace Finder定量软件建立定量方法，确定目标物含量。图2为扑草净在标准溶液和蛤肉阳性样品中的提取离子色谱图和二级质谱图，可以看出在阳性蛤肉样品中采集到的扑草净的保留时间、母离子和二级碎片离子的精确质量数与标准溶液中采集到的扑草净的保留时间和理论精确质量数基本一致，表明筛查结果准确可靠。可见，随着工业的发展，水体中农药类环境激素含量不断增加，水产品中农药类环境激素的监测应引起重视。

图2 扑草净在标准溶液(A,C)和阳性蛤肉样品(B,D)中的色谱图和二级质谱图Fig.2 Chromatograms and two-stage full mass scan spectra of prometryn in 10 μg/kg standard(A,C) and in positive clam sample(B,D)

3 结 论

本研究利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱，建立了快速定性筛查和定量分析水产品中28种农药类环境激素的方法。高分辨率质谱保证了复杂基质样品中基质干扰的消除，显著提高了目标物定性和定量结果的准确性，数据依赖的二级质谱全扫描进一步提高了定性的准确性。该方法快速、准确、灵敏，覆盖环境激素种类较广，可实现正负离子模式同时扫描，一次检测即可分析28种环境激素，并能准确定性定量，适用于水产品中农药类环境激素的快速筛查测定。

[1] Song D.GuangdongChem.Ind.(宋丹．广东化工)，2011，38(21)：192-193.

[2] Du K J,Xu X B.Chin.Sci.Bull.(杜克久，徐晓白．科学通报)，2000，45(21)：2241-2251.

[3] Cheng Y,Tan L C,Wang L,Zhou J Y,Shan Z J.PesticideScienceandAdministration(程燕，谭丽超，王蕾，周军英，单正军．农药科学与管理)，2014，35(5)：22-28.

[4] Cheng Y,Tan L C,Zhou J Y,Shan Z J.PesticideScienceandAdministration(程燕，谭丽超，周军英，单正军．农药科学与管理)，2014,35(4)：28-35.

[5] Chang A M,Zong D L,Liang D,Deng W B,Guan Y T.ChinaWaterandWastewater(常爱敏，宗栋良，梁栋，邓吴斌，管运涛．中国给水排水)，2009，5(18)：82-86.

[6] Duan J F,Lin L Q,Lin W H,Shi J H,Lin C.ModernFoodScienceandTechnology(段建发，林隆强，林文华，史佳虹，林超．现代食品科技)，2012，28(10)：1400-1402.

[7] Hu Y Q,Xi C X,Cao S R,Wang G M,Li X L,Zhang L,Zhang Y H.Chin.J.Chromatogr.(胡业琴，郗存显，曹淑瑞，王国民，李贤良，张雷，张云怀．色谱)，2014，32(7)：784-788.

[8] Zheng F,Pang G F,Li Y,Wang M L,Fan C L.Chin.J.Chromatogr.(郑锋，庞国芳，李岩，王明林，范春林．色谱)，2009，27(5)：700-710.

[9] Lü B,Chen D W,Miao H.J.Instrum.Anal.(吕冰，陈达炜，苗虹．分析测试学报)，2015，34(6)：639-645.

[10] Sun X J,Guo M M,Wang S Y,Tan Z J,Li Z X ,Zhai Y X.Chin.J.Chromatogr.(孙晓杰，郭萌萌，王苏玥，谭志军，李兆新，翟毓秀．色谱)，2014，32(10)：1124-1130.

[11] Sun J,Xu X,Li C M,Luo Q,Wang D H,Wang Z J.Chin.J.Anal.Chem.(孙静，徐雄，李春梅，罗茜，王东红，王子健．分析化学)，2015，43(8)：1145-1153.

[12] Zhan S X,Kuang Y Q,Li X Y,Guo X D.J.Instrum.Anal.(湛社霞，匡耀求，李秀英，郭新东．分析测试学报)，2015，34(8)：874-879.

[13] Xu J,Chen J,Wang L,Sun L H,Yuan Z Y,Ye H Y,Zhu L.J.Instrum.Anal.(徐娟，陈捷，王岚，孙灵慧，袁震宇，叶弘毅，朱林．分析测试学报)，2013，32(3)：293-301.

[14] Pan X B,Yi X H,Shi Y Y,Zhao S Z,Sheng Y G,Deng X J,Zhu J,Ding Z P.Chin.J.Anal.Chem.(潘孝博，伊雄海，时逸吟，赵善贞，盛永刚，邓晓军，朱坚，丁卓平．分析化学)，2016，44(7)：1125-1132.

[15] Liu H,Zhang Y L,Wang S L,Ding T,Xu N S,Gui Q W,Shen W J,Zhao Z Y,Wu B.J.Instrum.Anal.(柳菡，张亚莲，丁涛，王岁楼，徐牛生，桂茜雯，沈伟健，赵增运，吴斌．分析测试学报)，2014，33(5)：489-498.

Rapid Screening of 28 Pesticides Endocrine Disruptors in Aquatic Products by Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Quadrupole/Electrostatic Field Obitrap High-resolution Mass Spectrometry

JU Ling-yan1,LI Zhao-jie1*,WANG Jun2,XU Cheng-gang1,CUI Jia1

(1.Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Weihai 264200,China；2.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao 266001,China)

A rapid method was developed for the screening and quantification of 28 pesticides endocrine disruptors in aquatic products by ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field obitrap high-resolution mass spectrometry.The samples were extracted with ethyl acetate,and purified with a Captiva ND Lipids column.The separation was carried out on an ACQUITY UPLC@BEN C18column(2.1 mm×50 mm,1.7 μm) with methanol-water as mobile phases by gradient elution.The 28 pesticides endocrine disruptors were simultaneously analyzed in switching positive and negative modes.The retention time,accurate mass of parent ion and relative isotope abundance were used for fast screening in full scan mode,while accurate mass of fragment ions were used for comfirmation in two-stage threshold-triggered full mass scan mode.Under the optimal conditions,good linearities(r2>0.99) were obtained in their respective linear ranges.The limits of detections(LODs) for most compounds were not more than 10 μg/kg except for acetochlor,procymidone and fenitrothion.The recoveries were in the range of 65.7%-98.9% and the relative standard deviations(RSDs) were 6.2%-11.3%.The method was simple,sensitive and accurate,and was suitable for the rapid screening and confirmation of multiple pesticides endocrine disruptors in aquatic products.

ultra-performance liquid chromatography; obitrap high-resolution mass spectrometry; pesticides；endocrine disruptors; rapid screening

2017-08-17；

2017-09-20

山东检验检疫局科研计划项目(SK201602)；国家质检总局科研项目(2015IK202)

*

李兆杰，博士研究生，高级工程师，研究方向：食品安全,Tel：0631-3807370,E-mail:yihan82527@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.12.005

O657.7；O657.63

A

1004-4957(2017)12-1445-07