基于ISSR技术对西藏巨柏遗传多样性研究

王耀杰，李梓硕，刘 硕，李双辉，赵是栋，雷 培，孟凡娟*，王 超，关法春，桑利群

（1.东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.吉林省农业科学院，吉林长春 130124；3.西藏农牧学院，西藏林芝 860000）

基于ISSR技术对西藏巨柏遗传多样性研究

王耀杰1，李梓硕1，刘 硕1，李双辉1，赵是栋1，雷 培1，孟凡娟1*，王 超2，关法春2，桑利群3

（1.东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.吉林省农业科学院，吉林长春 130124；3.西藏农牧学院，西藏林芝 860000）

为研究来自不同地区的野生西藏巨柏的遗传多样性，利用ISSR技术对39株西藏巨柏的遗传关系进行分析。结果表明：利用2个最适引物共扩增出289条条带，遗传多样性较高，多态位百分点为96.16%，有效等位基因数为1.76，观测等位基因数为1.96，Shannon多样性指数为0.60，种群总基因多样性为0.44，种群内基因多样性为0.41，基因流为7.33。可见巨柏个体间存在明显基因流动。本研究对巨柏种群保存和进化研究有重要意义。

巨柏；遗传多样性；ISSR

巨柏Cupressus gigantea又名雅鲁藏布江柏木，属于柏科Cupressaceae柏木属Cupressus植物，于1975年在西藏东部发现[1]，是西藏地区特有的濒危国家珍稀二级物种[2]，主要分布于雅鲁藏布江中游朗县至米林、林芝等沿江两岸的河谷地带，平均海拔3 000～3 400 m，呈斑块状和狭带状生长[3]。尽管西藏巨柏具有很高的经济效益和生态价值，但是其群体分布区域较小，数量稀少，而且由于近年来自然环境破坏和人类活动干扰，导致巨柏种群整体呈明显衰退现象[4-5]。本试验利用ISSR分子标记技术，研究和分析巨柏的遗传多样性，不仅有利于巨柏的种群扩大和稳定发展，而且对西藏地区的物种多样性和生态发展具有重要价值，从而为其更好地保护管理、自然更新、扩大种群等方面的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生巨柏种子来自西藏雅鲁藏布江沿岸路段。该地区属于森林和草原的过渡带，光照充裕。巨柏种子共计39个样品，均种植在东北林业大学遗传学实验室。2017年4月选取植株长势一致、挺拔、生长旺盛的巨柏植株，随机采集9个不同地点（A、B、C、D、E、F、G、H、I）的样本进行试验，选择分布地主要为郎县和米林县自然分布区，具体见表1。

表1 西藏巨柏的9个种群的地理信息

1.2 试验设计

1.2.1 ISSR-PCR扩增体系

引物选用加拿大哥伦比亚大学公布的100个ISSR随机引物中的10个。经过预试验筛选，选出PCR产物条带清晰、明亮、多态性丰富、重现性高的引物进行实验，以其中多态性高、稳定性好的2个引物 UBC808(5′-AGA GAG AGA GAG AGA GC-3′)，UBC841（5′-GAG AGA GAG AGA GAG AYC-3′）对所有样品进行扩增。退火温度由引物合成公司说明书提供，再进行（Tm±1～2）℃的筛选，选出最适温度。虽然引物差异较大，选用的2个引物退火温度不同，但是PCR产物条带清晰，是后续实验的最适温度。试验采用20 μL的PCR反应体系：3 μL DNA模板 ；0.3 μL 引 物（20 μmol·μL-1）；2 dμL dNTP Mixture（2.5 mmol·μL-1）；2 μL 的 10×PCR Buffer；0.3 μL的Taq酶（5 U·μL-1）。PCR程序为：94 ℃变性5 min，94 ℃ 30 s，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40个循环，72℃7 min，冷却至10℃，4℃保存。

1.2.2 琼脂糖电泳

对PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电泳，Gel-Red染色。取10 μL PCR产物与1 μL 10×Loading Buffer混合后点样，2 000 bp DNA marker（TaKaRa基因科技公司）110 V，60 min。电泳后用Universal HoodⅡ凝胶成像仪（沈阳百瑞德进出口贸易公司）照相保存并记录结果。

1.2.3 数据统计

以DM2000的Marker为分子量的标准，统计每个样品扩增后的条带，并选取清晰、明亮的条带。使用PopGene 1.32软件进行遗传多样性数据分析，使用NTSYS-PC 2.1软件进行巨柏种群聚类分析。在凝胶上同一条带同一位置有条带的视为1，无条带的视为0，生成0-1原始数据矩阵，输入计算机，生成表格。

2 结果与分析

2.1 ISSR标记的遗传多态性分析

如图1所示，用2个引物对9个巨柏居群39个样品进行PCR扩增，共扩增出289个条带，平均每个样品扩增出7.41条。条带清晰易分辨，扩增的条带长度为250～2 000 bp，各材料之间条带的大小和多态性不同。

图1 引物UBC-808的PCR扩增产物

2.2 基于ISSR标记的遗传相似系数分析

使用软件对选取的39个样品巨柏的ISSR-PCR产物电泳结果进行分析发现：多态位点百分率（PPB）为 96.16%，有效等位基因数 Ne（Effective number of alleles）为 1.76，观测等位基因数 Na为1.96，Shannon多样性指数为0.60，遗传分化系数Gst为0.06。种群总基因多样性Ht为0.44，种群内基因多样性Hs为0.41，基因流Nm为7.33。

2.3 基于ISSR标记的聚类分析

利用NTSYS 2.10e软件对39个样品进行遗传相似性系数分析，构建聚类分析树状图。如图2所示，39个巨柏样品在遗传相似系数0.51处分为两大类，而在遗传相似系数0.64处可分为5个大类，第一类主要为居群A、B、I、E、F等；第二类为居群2、6；第三类为居群H、I、E、F等；第四类主要为居群B、C和D。第五类主要为居群除A以外，均有所涉及。

图2 西藏巨柏的聚类分析树状图

3 结论与讨论

通过对野生西藏巨柏的ISSR分子标记研究发现，西藏野生巨柏居群整体遗传多样性水平较高，但遗传分化程度偏低。其中多态位点百分率为96.16，表明选取的巨柏群体整体遗传多样性高。有效等位基因数为1.76，观测等位基因数为1.96，Shannon多样性指数为0.60，这些都说明巨柏的遗传多样性较高，这也许利于巨柏的进化，以适应多变的环境。同时种群总基因多样性为0.44，种群内基因多样性为0.41，基因流为7.33，居群间的基因多样度为0.028 3，这表明在巨柏物种水平上，有2.83%的遗传变异存在于居群间；基因流数值较小，种群间基因交流不频繁。但是由巨柏遗传聚类分析图可知：39个巨柏样品没有较明显的聚类情况，而是分散在其他居群内，说明野生巨柏居群间存在一定的基因流动。结合取样地理分布图可知，地理分布范围是决定巨柏种遗传多样性的重要因素，且相邻地区的居群间趋向于更髙的遗传一致度，表现出很高的遗传相似性。地理位置相近的居群之间基因交流如花粉、种子传播较频繁，表现为较近的亲缘性。

综合以上分析发现，采用ISSR技术可以有效揭示西藏巨柏居群间及种间的遗传多样性、遗传分化程度和亲缘关系。而且根据源自相近地区的巨柏种有聚集在一起的趋势，但是较为分散，且遗传多样性较为丰富。这是否是由于环境条件改变和种群发展进化的不同阶段发生不同的基因表达，或者是漫长的生存和进化过程使巨柏具备更高的遗传多样性，为此，还需要从多种角度进行更进一步的深入研究。但是我们必须注意的是，由于巨柏丰富的遗传特性，更适合就地保存。总之，研究巨柏种间和居群内遗传多样性对珍稀物种的保护、培养和遗传信息分析较为重要。

［1］郑万钧，傅立国，诚静容.中国裸子植物[J].植物分类学报，1975，13（4）：56-90.

［2］傅立国.中国珍稀濒危植物的福音-国家重点保护植物名录公布在即[J].植物杂志，1995（3）：2-3.

［3］郑维列，薛会英，罗大庆，等.巨柏种群的生态地理分布与群落学特征[J].林业科学，2007，43（12)：8-15.

［4］于永福.国家重点保护植物名录[J].植物杂志，1999（5）：4-11.

［5］汪松，解炎.中国物种红色名录[M].北京：高等教育出版社，2004.

［6］壮青.高原巨柏傲苍穹[J].科学实验，1977（11）：5-6.

Analysis of genetic diversity of Cupressus gigantea in Tibet by ISSR marker

WANG Yaojie1,LI Zishuo1,LIU Shuo1,LI Shuanghui1,ZHAO Shidong1,LEI Pei1,MENG Fanjuan1*,WANG Chao2,GUAN Fachun2,SANG Liqun3
（1.College of Life Science,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China;2.JilinAcademy ofAgricultural Sciences,Changchun 130124,China;3.XizangAgricultureandAnimalHusbandryCollege,Linzhi860000,China）

To study the genetic diversity of the wildCupressus giganteaspecies in Tibet,39 samples were analyzed by ISSR molecular marker technology.289 bands were amplified by two suitable primers.The number of polymorphic alleles was 96.16%,the number of effective alleles was 1.76,the observed allele number was 1.96,Shannon diversity index I was 0.60,the total population diversity was 0.44,diversity Hs was 0.41 and gene flow was 7.33.These results showed that there was significant gene flow between populations.This study is meaning for the conservation and evolution ofCupressus gigantean.

Cupressus gigantea;genetic diversity;ISSR

Q781

A

1001-1714（2017）06-0012-03

2017-08-26

国家自然科学基金项目（41464054）；东北林业大学大学生创新项目（201710225303）。

王耀杰（1995-），男，本科生，主要从事植物逆境生理与分子生物学研究。E-mail：1870640125@qq.com。

*通讯作者：孟凡娟（1975-），女，教授，博士，主要从事植物逆境生理与分子生物学研究。E-mail：mfj19751@163.com。

张素清）