血液系统恶性肿瘤病人外周血NK细胞及其受体检测的临床意义

孔令环,马寅芙,吕作福,韩 梅,肖中平,高 鹏

(吉林省人民医院,吉林 长春130021)

血液系统恶性肿瘤病人外周血NK细胞及其受体检测的临床意义

孔令环*,马寅芙,吕作福,韩 梅,肖中平,高 鹏

(吉林省人民医院,吉林 长春130021)

目的探讨血液系统恶性肿瘤病人外周血NK(CD3-CD16+CD56+)细胞及其受体检测的临床意义。方法用流式细胞术检测18例正常对照及20例淋巴瘤、22例急性白血病、16例MDS病人外周血NK细胞占淋巴细胞百分比，NK细胞膜活化性受体NKG2D和抑制性受体NKG2A及穿孔素、颗粒酶的表达。结果(1)初治淋巴瘤和白血病组NK细胞数量显著低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)，MDS组与正常对照组无显著性差异(P>0.05)；(2)初治淋巴瘤组、白血病组、MDS组活化性受体NKG2D表达均显著低于正常对照组(P<0.05)，差异有统计学意义；淋巴瘤组、白血病组、MDS组抑制性受体NKG2A与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。(3)初治淋巴瘤组和白血病组的穿孔素、颗粒酶表达均显著低于正常对照(P<0.05)，差异有统计学意义。MDS组穿孔素、颗粒酶表达与对照组无显著性差异(P>0.05)。结论淋巴瘤、白血病病人免疫功能减低与NK细胞数量减少及NKG2D、穿孔素、颗粒酶表达减少有关，MDS病人免疫功能减低可能只与NKG2D表达减低有关。

恶性；淋巴瘤；白血病；急性；杀伤细胞，天然；受体；穿孔素；颗粒酶

(ChinJLabDiagn,2017,21:2079)

血液系统恶性肿瘤的主要发病机制是机体免疫系统发生紊乱，不能及时发现或清除异常细胞，而导致异常细胞恶性克隆性增殖并浸润其他器官或组织[1]。NK(CD3-CD16+CD56+)细胞是机体免疫系统的重要组成成分，具有自然杀伤、分泌细胞因子、趋化因子、参与调节免疫的作用，在机体抗感染、抗肿瘤、清除衰老正常细胞和异己细胞的过程中发挥重要作用[2-4]。本研究通过检测外周血NK细胞数量及受体的表达，来探讨NK细胞数量及功能的变化在血液系统恶性肿瘤发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1研究对象

选取本院2015年1月-2016年7月血液系统恶性肿瘤病人58例为研究对象，其中初治白血病组22人，淋巴瘤组20人，MDS组16人。男32例，女26例，年龄22-75岁。其中急性淋巴细胞白血病(ALL) 6例，急性髓细胞白血病(AML)16例；弥漫大B细胞淋巴瘤10例，套细胞淋巴瘤6例，滤泡淋巴细胞淋巴瘤4例；MDS-RCMD3例，MDS-RAEB16例,MDS-RAEB27例；对照组18例，均为本院健康体检者，男10例，女8例，年龄31-53岁。标本的留取均获得知情同意。

1.2试剂和仪器

单抗购自BD公司，鼠抗人CD3-ECD、CD56-PC5、CD16-PC5 、CD159- PE(抑制性受体NKG2A)、CD314-FITC(活化性受体NKG2D)、granzymeβ-PE(颗粒酶β)、胞质蛋白perforin-FITC(穿孔素)、溶血素、破膜剂、同型对照；流式细胞仪为美国贝克曼公司的多参数EPICS XL型流式细胞仪，应用EXPO32ADCXL4 Color软件分析，在FSC-SSC散点图上选定淋巴细胞群，结果以百分率表示。

1.3方法受试者于清晨空腹采静脉血2 ml，EDTA抗凝,流式细胞术检测。

1.4统计学处理

2 结果

2.1血液系统恶性肿瘤病人外周血NK细胞的变化

见图1。初诊淋巴瘤组与白血病组病人外周血NK细胞表达减低，分别为(7.94±3.01)%、(9.98±6.04)%，与正常对照组差异有统计学意义[14.3±6.24)%，P<0.05]；MDS组病人外周血NK细胞数(14.73±7.7)%，与正常对照组差异无统计学意义[(14.3±6.24)%，P>0.05]；治疗后淋巴瘤组、白血病组、MDS组3组病人外周血NK细胞表达分别为(17.28±5.53)% 、(14.2±7.04)%、(16.9±4.68)% ，与正常对照组差异无统计学意义[(14.3±6.24)%，P>0.05]。

图1 血液系统恶性肿瘤病人外周血NK细胞数量的变化

2.2血液系统恶性肿瘤病人外周血NK细胞膜活化性受体、抑制性受体表达

见图2。初诊淋巴瘤组、MDS组、白血病组病人外周血NK细胞膜活化性受体NKG2D表达均减低，分别为(40.52±11.23)%、(51.98±22.06)%、(45.04±27.81)%，与正常对照组均有显著性差异[(66.97±14.32)%，P<0.05]，差异有统计学意义；三组治疗后NKG2D表达均增加，分别为(62.78±12.08)%、(65.3±11.26)%、(60.5±18.3)%，与正常对照组无显著性差异[(66.97±14.32)%，P>0.05]。

图2 血液系统恶性肿瘤病人外周血NK细胞膜活化性受体(NKG2D)表达

见图3。初诊淋巴瘤组、MDS组、白血病组3组病人外周血NK细胞膜抑制性性受体NKG2A表达分别为(22.75±9.39)%和(19.71±10.9)%，(17.97±12.26)%，与正常对照组无显著性差异[(20.0±9.75)%，P>0.05]。治疗后三组NKG2A表达分别为(13.93±8.54)%和(13.71±9.9)%，(28.1±10.26)%，与正常对照组无显著性差异[(20.0±9.75)%，P>0.05]。

图3 血液系统恶性肿瘤病人外周血NK细胞膜抑制性受体(NKG2A)表达

2.3血液系统恶性肿瘤病人外周血NK细胞胞质穿孔素、颗粒酶-β表达

见图4，图5。初诊淋巴瘤组和白血病组病人外周血NK细胞胞质穿孔素表达均减低，分别为(46.74±16.91)%和(54.65±29.61)%，与正常对照组差异有统计学意义[(71.98±13.41)%,P<0.05]；MDS组病人外周血NK细胞胞质穿孔素表达为(69.71±17.89)%，与正常对照组无显著性差异[(71.98±13.41)%，P>0.05]。治疗后淋巴瘤组、白血病组、MDS组病人外周血NK细胞胞质穿孔素表达均增加，分别为(81.02±14.31)%、(64.2±25.12)%、(80.6±15.41)%，与正常对照组无显著性差异[(71.98±13.41)%，P>0.05]。

图4 血液系统恶性肿瘤病人外周血NK细胞胞质穿孔素(perforin)表达

淋巴瘤组、白血病组病人外周血NK细胞胞质颗粒酶-β表达分别为(13.82±7.14)%和(26.59±21.88)%与正常对照组差异有统计学意义[(46.15±16.97)%,P<0.05]；MDS组病人外周血NK细胞胞质颗粒酶-β表达(36.87±10.31)%与正常对照组无显著性差异[(46.15±26.97)%，P>0.05]；治疗后淋巴瘤组、白血病组、MDS组病人外周血NK细胞胞质颗粒酶-β表达均增加，分别为(65.31±13.31)%、(29.91±20.48)%、(39.87±12.53)%，与正常对照组无显著性差异[(46.15±26.97)%，P>0.05]。

图5 血液系统恶性肿瘤病人外周血NK细胞胞质颗粒酶-β(granzyme β)表达

3 讨论

自然杀伤(NK)细胞是天然免疫应答中关键的效应细胞，是机体抗肿瘤作用的第一道防线。在外周血中具有明显的分布优势,故对血液系统疾病的控制具有意义[5]。本研究通过对58例血液系统恶性肿瘤分析，发现MDS组病人外周血NK细胞数量与正常对照无显著性差异；淋巴瘤组和白血病组病人外周血NK细胞数明显减低，与正常对照组差异有统计学意义，治疗后NK细胞数量均明显回升，与正常对照组无显著性差异。这一结果提示，经过化疗后淋巴瘤和白血病病人的免疫功能得到恢复。徐述[6]等报道，MDS患者NK细胞数量与对照组无明显差异。郑淑霞等[7]报道，淋巴瘤急性期和AML急性期NK细胞数与对照组比有显著差异；与本研究结果一致。

活化性受体NKG2D是NKG2家族中免疫活性最强的活化性受体，也是目前公认的在抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用的受体，其表达水平几乎决定了机体NK细胞免疫应答的强弱，在抗肿瘤免疫中起重要作用[8]。沈亚娟等报道[9]，肿瘤患者NK细胞膜上的活化性受体NKG2D表达水平降低，而使NK细胞的杀伤功能受到抑制。武晓博等[10]报道，经化疗后，淋巴瘤组、急性白血病组、MDS组的活化性受体均明显回升。本研究与报道一致，初诊淋巴瘤组、白血病组、MDS组病人外周血NK细胞膜活化性受体NKG2D表达均减低，与对照组相比差异有统计学意义；治疗后三组病人的NK细胞活化性受体NKG2D表达均增加，与正常对照组无显著性差异。NK细胞通过抑制性受体特异性识别靶细胞表面的MHC I类分子并保护正常细胞不被杀伤，研究发现，淋巴瘤组、白血病组、MDS组三组的NK细胞抑制性受体表达与正常对照组无显著性差异，即NK细胞的识别能力没变，但杀伤能力减低。因此，机体免疫功能的强弱不仅与NK细胞数量有关，更与活化性受体的表达有直接关系，活化性受体表达减低导致机体免疫功能减低或免疫功能紊乱，引起血液系统恶性肿瘤的发生。

NK细胞活化后，通过释放穿孔素、颗粒酶-β等大量细胞毒性颗粒发挥自然杀伤功能，导致靶细胞死亡。研究发现，初诊淋巴瘤组和白血病组病人外周血NK细胞胞质穿孔素、颗粒酶-β表达均减低，与正常对照组相比差异有统计学意义；治疗后与正常对照无显著性差异。MDS组病人外周血NK细胞胞质穿孔素、颗粒酶-β表达与正常对照组无显著性差异；因此，考虑MDS病人免疫功能减低仅与NK细胞的活化性受体NKG2D表达减低有关。而淋巴瘤、白血病病人免疫功能减低不仅与NK细胞数量减少有关，还与NKG2D、穿孔素、颗粒酶表达减少有关。由于急性白血病病人和淋巴瘤病人外周血NK细胞胞质穿孔素、颗粒酶表达均减低，使得肿瘤细胞获得免疫逃避而过度增殖，浸润组织器官，这可能是急性白血病来势凶猛及淋巴瘤容易浸润骨髓等脏器的原因之一。

[1]顾科峰，陈琳军，邓晓辉，等.恶性血液病治疗恶性血液病患者治疗前后外周血NK细胞亚群变化的特点及其临床意义[J].实用医学杂志，2013，29(13)：2154.

[2]Fietta P，Delsante G.Focus on human natural killer cells[J]．Riv Biol，2009，102(2)：219．

[3]Hoover RG,Gullickson G,Kombluth J．Impaired NK cytolytic activity and enhanced tumor growth in NIT lytic-associated molecule-deficient mice[J]．Immunol,2009，183(11)：6913．

[4]Sun JC，Beilke JN，Lanier LL．Adaptive immune factures of natural killer cells[J]．Nature，2009，457(7229)：557．

[5]潘 莹，王会平，张 翠，等.流式细胞数在侵袭性NK细胞白血病诊断中的价值：一例报道并文献复习[J].白血病·淋巴瘤，2014，23(1)：38.

[6]徐 述，许勇钢，杨晓红，等.骨髓增生异常综合征患者先天性免疫细胞数量和功能分析[J].中国免疫学杂志，2009，25：596.

[7]贺建霞，赵志强，王艳峰，等.非霍奇金淋巴瘤患者外周血T细胞亚群及NK细胞检测的临床意义[J].白血病·淋巴瘤,2013，22(7)：436.

[8]常 鑫，马 莉，曾小菁，等．白血病患者NK细胞表面NKG2D受体及其配体MICA/B的研究[J]．中国免疫学杂志，2009,25(2):174．

[9]沈亚娟，张 建，田志刚，肿瘤患者自然杀伤细胞受体NKG2A和NKG2D的表达[J].检验医学，2008，23(4)：384.

[10]武晓博，张巧花，侯淑玲，等.难治性淋巴瘤患者外周血T淋巴细胞亚群与自然杀伤细胞活性的检测及临床意义[J].白血病·淋巴瘤，2011，20(3)：162.

ClinicalsignificanceofnaturalkillcellanditsreceptorinperipheralbloodofpatientswithHematologicMalignant

KONGLing-huan,MAYin-fu,LÜZuo-fu,etal.

(JilinProvinceHospital,Changchun130021,China)

ObjectiveTo study the clinical significance of NK(CD3-CD16+CD56+) cell and its receptor in peripheral blood of hematologic malignant.MethodsBy flow cytometry，the percentage of NK cell in peripheral blood lymphocytes was detected in 20 lymphoma,22 acute leukemia，16 MDS and 18 healty adults.NK cell activation receptor (NKG2D),inhibitory receptor (CD159),perforin and granzyme of patients were also detected.Results(1)The percentage of NK cell in newly diagnosed lymphoma group and acute leukemia group was significantly lower than those of normal controls(P<0.05).But it had no significant in MDS group than that of normal controls(P>0.05).(2)The expression of NKG2D were significantly lower than those of normal controls(P<0.05) in the newly diagnosed lymphoma groups,acute leukemia group and MDS group.But the expression of NKG2A among the 3 groups had no significant than that of normal controls(P>0.05).(3)The expression of perforin and granzyme both in the newly diagnosed lymphoma group and acute leukemia group were significantly lower than those of normal controls(P<0.05).But the MDS group had no significant than that of normal controls(P>0.05).ConclusionThe cellular immune is suppressed in lymphoma and acute leukemia patients.That was correlated with the lower expression of NK cell,activation receptor (NKG2D),inhibitory receptor (CD159),perforin and granzyme.Perhaps that was only correlated with the lower expression of NKG2D about MDS patients.

malignancy;lymphoma;Leukemia;acute;killer cells ，natural;receptor;perforin;granzyme

吉林省科技厅项目20150101145JC

*通讯作者

1007-4287(2017)12-2079-04

R331.4

A

2017-01-15)