兔眼蓝莓初代培养的建立

郭丽郑志新武延生

（1邢台学院化学工程与生物技术学院河北邢台054001；2河北北方学院园艺系河北张家口075000）

兔眼蓝莓初代培养的建立

郭丽1郑志新2武延生1

（1邢台学院化学工程与生物技术学院河北邢台054001；2河北北方学院园艺系河北张家口075000）

以兔眼蓝莓栽培品种‘北陆’当年生带腋芽的茎段为试材，探讨其初代培养过程中消毒时间和生长调节剂配比浓度对芽诱导率的影响。试验结果表明：兔眼蓝莓茎段最佳消毒时间是以70%酒精处理30s与0.1%升汞处理8min，以MS+6–BA 0.5mg/L+IBA 0.2mg/L+ZT 2.0mg/L为培养基的芽诱导效果最好，诱导率可达79.0%。

兔眼蓝莓；初代培养；消毒时间；生长调节剂

蓝莓，学名越橘(Vaccinium vitis–idaea)，属杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)，多年生落叶或常绿矮小灌木，原产于北美[1]。目前生产栽培的主要品种分为三大类：高丛蓝莓、矮丛蓝莓和兔眼蓝莓。兔眼蓝莓是从野生兔眼越橘类中选育出的栽培品种，由于果实在未成熟前颜色如兔眼一般红，所以取名为兔眼蓝莓[2]。

蓝莓果实酸甜可口，具有独特的营养保健功能，因含有较多的花色苷、黄酮等生理活性物质，具有改善视力、延缓脑神经衰老、防止心血管疾病、提高人体免疫力等功效，是世界粮农组织推荐的五大健康水果之一[3,4]。蓝莓的常规繁殖方法速度较慢、繁殖规模受到阻碍且苗木在生长势、果实品质等诸多方面存在不足。为满足市场需要，迅速扩大蓝莓的生产规模，采用组培法能在较短时间内获得大量优质苗木。

1 材料与方法

1.1 材料。供试材料为兔眼蓝莓栽培品种‘北陆’的当年生带腋芽的茎段，取自河北北方学院农林科技学院温室。

1.2 方法

1.2.1 外植体的消毒处理与接种。将采回的外植体用剪刀剪成约2cm长的茎条，去除叶片，保留腋芽，用洗衣粉水浸泡30min后，再用流水冲洗2h，然后在超净工作台上进行消毒处理[5]。先用70%酒精浸泡30s，用无菌水冲洗2～3次，再在0.1%升汞中浸泡，设定浸泡时间为4min、6min、8min、10min，无菌水冲洗5次，然后将材料放于无菌滤纸上吸干水分。切去茎条上下两端的伤口部分，将其剪成0.5～1cm的单芽茎段，接种于培养基上[3]。每个处理接种10瓶，每瓶3～4个外植体，3次重复。所用基本培养基均为MS培养基，添加琼脂6g/L，蔗糖30g/L，pH值为5.6～5.8。

1.2.2 培养条件。接种的茎段置于25±2℃培养室中培养，光照强度2000lx，每日持续光照16h，14d后统计结果。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对外植体灭菌效果的影响。在消毒处理中分别用0.1%升汞浸泡4min、6min、8min和10min。接种14d后污染率和死亡率结果见表1。处理A的污染率最高，达到73.3%，由于消毒时间短，导致消毒不够彻底，还存在大量杂菌，消毒效果不理想；随着消毒时间逐渐延长，处理B、C、D的污染率分别降至46.7%、26.7%、13.4%，处理B与处理C、D差异显著，处理C与处理D差异不显著。同时，随着消毒时间逐渐延长，死亡率也呈递增的趋势，分别为10%、16.7%、23.4%、43.4%，处理D与处理A、B、C存在显著性差异，说明0.1%升汞是强消毒剂，随着消毒时间的延长，对外植体细胞的伤害程度也会增大，从而导致外值体死亡；处理C与处理D比较，污染率相差不大，且处理D比处理C的污染率要高，所以处理C最合适。综上所述，处理C的污染率、褐变与死亡率均在可接受范围内，在一定程度上既消灭了杂菌又不至于对外植体产生较大毒害，所以用0.1%升汞处理外植体8min较好。

表1 不同灭菌时间对外植体污染率和死亡率比较

2.2 不同生长调节剂配比浓度对芽诱导的影响。将没有受污染和死亡的兔眼蓝莓茎段转接到诱导培养基上进行诱导培养，所设培养基配方及诱导结果见表2。由表2可知，以6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+ZT 2.0mg/L的培养基对芽诱导效果最好，达到79.0%。在BA和IBA一定时，随着ZA的浓度不断增加，芽诱导率先增加，然后降低。当ZT为2.0mg/L时，芽诱导率最高；当ZT为3.0mg/L时，芽诱导率下降到70.2%。可见，低浓度的ZA对芽诱导起到了促进作用，随着ZA浓度升高，芽诱导效果降低，高浓度ZA对芽诱导具有抑制作用。试验结果表明，最适宜的兔眼蓝莓芽诱导培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+ZT 2.0mg/L。

表2 不同生长调节剂配比浓度对芽诱导的影响

3 结论与讨论

3.1 结论。采于温室中的试验材料，很容易粘附细菌和真菌等。在组织培养中，外植体的消毒效果直接关系到后续芽诱导的效果及组培苗的成活率，确定最佳的消毒方式与时间不可或缺。本试验通过研究消毒时间的长短，筛选出以兔眼蓝莓茎段为外植体的最佳消毒方法为：70%酒精浸泡30s后0.1%升汞浸泡8min。同时，添加一定浓度的生长素和细胞分裂素对于诱导兔眼蓝莓的芽具有明显的促进作用。在兔眼蓝莓初代培养的过程中，以MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+ZT 2.0mg/L为培养基配方的芽诱导效果最佳，诱导率达到79.0%。

3.2 讨论。菌类污染是植物组织培养中较为常见的问题，使用的消毒剂既要能够把外植体表面的杂菌杀死，又必须容易被无菌水从外植体上冲洗干净而不至于对外植体本身产生较大的毒害作用进而影响其正常生长[5]。0.1%升汞是组织培养中常用的强消毒剂，且较难除去残留，具有很强的穿透力和杀伤力，容易杀死和损伤细胞，造成外植体的死亡，但其消毒效果也比较明显。因此在使用时，应当控制好消毒的具体时间，用后要以大量的无菌水多次冲洗，在降低污染率的同时，还要尽可能减少消毒剂对外植体的伤害。所以，筛选准确的消毒时间对后续工作有至关重要的作用。

植物分化是一个复杂的生理生化过程，植物生长调节物质的种类、浓度及组合对不定芽的诱导有极其关键的作用。在植物组织培养过程中，愈伤组织的诱导、芽苗的生长受生长素和细胞分裂素的调控。细胞分裂素能诱导不定芽的形成，削弱顶端优势，促进侧芽分化和生长；生长素能促进细胞伸长，诱导愈伤组织产生特别是当二者有效结合时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成[6]。本试验中，单独添加6-BA与IBA的诱导效果较一般，当添加ZT后，芽诱导率得到有效提高，可见ZT是植物组织培养中的关键因素[7]。同时，采用不同的6-BA、IBA与ZT配比浓度，芽诱导的效果也存在差异。试验表明，当使用6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+ZT 2.0mg/L的植物生长调节剂配比时，芽诱导率得到显著提高，达到79.0%。

本试验对兔眼蓝莓的初代培养进行了研究，确定了外植体的最佳消毒方法。通过在MS基本培养基上添加不同浓度的BA、IBA和ZA来比较芽诱导的效果，但其它种类和浓度的生长素和细胞分裂素以及不同种类的基本培养基对于兔眼蓝莓初代培养的影响和作用还需要进一步深入的研究。

[1]宋刚，徐银，宋金耀，等.不同因素对高丛越橘叶片初代培养的影响[J].江苏农业科学，2010(4)：44～45.

[2]茨韦特科夫·约旦，杨帆，赵燕丽，等.引进国外蓝莓品种的组织培养及快繁技术研究[J].黑龙江农业科学，2011(6)：6～8.

[3]孙书伟.蓝莓组培苗瓶内生根的探讨[J].湖北农业科学，2009，48(4)：786～788.

[4]陈爱美，李凌，曾明.影响兔眼越橘初代培养的因素分析[J].生物技术，2004，14(4)：61.

[5]郑伟尉，吕锡山，慎家辉，等.兔眼蓝莓“园蓝”离体培养增殖技术研究[J].中国南方果树，2013，42(1)：89～91.

[6]郑春明.植物组织培养技术[M].杭州：浙江大学出版社，2011.

[7]李杰，王明莹，黄学文，等.不同玉米素浓度对蓝莓茎段芽诱导的影响[J].现代农业科技，2013(2)：85～89.