艾灸干预肝郁脾虚型抑郁大鼠海马CaMKⅡ表达研究*

张 淼,刘慧慧,董宝强,李瑞杰,张小卿

(辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847)

实验研究

艾灸干预肝郁脾虚型抑郁大鼠海马CaMKⅡ表达研究*

张 淼,刘慧慧,董宝强,李瑞杰,张小卿△

(辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847)

目的：探讨艾灸对抑郁症模型大鼠大脑海马组织钙调蛋白信号通路中钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的影响，以阐释艾灸治疗肝郁脾虚型抑郁症的作用机制。方法：选择72只雄性Wistar大鼠，体质量(150±20)g。随机分为正常组、抑郁模型组、艾灸预防组、氟西汀预防组、艾灸治疗组和氟西汀治疗组，每组12只。适应性喂养后，进行抑郁症造模。氟西汀预防组和艾灸预防组从第7天～18天在造模前1 h给予预防治疗；氟西汀治疗组和艾灸治疗组在成模后即19天～31天进行治疗。取大鼠海马组织，qPCR方法检测大鼠海马CaMKⅡ基因表达，WB检测大鼠CaMKⅡ及其磷酸化蛋白表达。结果：与正常组相比，模型组CamkⅡ的基因表达、蛋白含量及磷酸化蛋白表达均明显降低；与模型组相比，氟西汀预防组、艾灸预防组、氟西汀治疗组和艾灸治疗组基因表达、蛋白含量及磷酸化蛋白表达均显著升高；艾灸治疗组CamkⅡ基因及蛋白磷酸化水平均明显低于艾灸预防组。结论：艾灸可以特异性增高肝郁脾虚模型大鼠海马CaMKⅡ基因表达，促进CaMKⅡ蛋白磷酸化，在治疗与延缓抑郁症发生发展过程中均起到显著的作用，且基于“治未病”思想指导下的艾灸在抑郁症预防方面具有明显优势。

艾灸；抑郁症；肝郁脾虚型;CaMKⅡ；蛋白磷酸化

抑郁症属多种原因引起，以持续情绪低落为主要症状的精神疾病。临床表现为心情抑郁、思维迟钝、兴趣减退、意志活动减少，并伴有焦虑不安、食欲减退、性功能减退、睡眠障碍等症状。目前我国抑郁症的发病机率为3%～5%，已超过2600万人，15%～20%有自杀倾向[1]。然而其发病机制并不完全明确，现代医学主要采用抗抑郁药物进行长期治疗，但使用抗抑郁药物均会导致不同程度的副作用。给患者带来不同程度的不良反应，影响患者心血管、消化、内分泌等系统稳态，若长期大剂量服用，不仅会产生耐药性还可引起单胺类递质合成障碍，加重抑郁症状表现，给患者生活工作带来极大负担。研究表明，肝郁脾虚型抑郁症覆盖全部病例的40.4%，是抑郁症主要的中医证候类型[2]。因此研究肝郁脾虚型抑郁症的预防与治疗方法在临床医疗过程中具有重大的意义。

近年来中医“治未病”的思想已逐渐普及，艾灸预防及治疗抑郁症的发生发展也逐渐在临床广泛应用。但是艾灸预防及治疗抑郁症机理尚不明确，因此本研究拟通过肝郁脾虚型抑郁症大鼠，采用艾灸预防治疗的方法，观察艾灸对大鼠海马CaMKⅡ基因表达及其磷酸化含量的影响，进一步促进艾灸预防在临床广泛应用，拓宽临床医生诊疗思维，减少抑郁症发病率，延缓疾病发生发展。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

实验采用SPF级雄性Wistar大鼠72只，体质量(150±20)g，大鼠由辽宁长生生物技术有限公司提供[许可证号SCXK(辽)2015-0001]。大鼠在辽宁中医药大学SPF级动物实验中心适应性饲养1周后，按随机数字表法分为6组：正常组、抑郁模型组、艾灸预防组、氟西汀预防组、艾灸治疗组和氟西汀治疗组，各12只。造模组大鼠均行单笼饲养。

1.2 主要实验试剂及仪器

艾柱：圆径0.7 cm，长3.5 cm(南阳市康泽艾草制品有限公司)、氟西汀药片(礼来苏州制药有限公司)；CaMKⅡ一抗(CST美国，D11A10)，pCaMKⅡ一抗(CST美国，D21E4)，β-action(北京全式金，K30226)，二抗(康为世纪，CW0103S)，Maker(康为世纪，CW0986M)，ECL发光液(索莱宝，EOO10-A，EOO10-B)，凝胶配制试剂盒(博士德，AR0138)，RIPA裂解液(索莱宝，R0020)，蛋白测定试剂盒(鼎国，BCA01，BCA02)；PCR反转录试剂盒(宝生物工程，AK3501),荧光定量PCR扩增试剂盒(QIAGEN德国，330524)；超微量紫外分光光度计(Thermo，NANODROP 2000)；逆转录仪(Applied Biosystems)；荧光定量PCR仪(Applied Biosysterms 7500 Fast Real-Time PCR Systerm)；TriStar2 LB 942型多功能酶标仪(Berthold company伯托，德国)；Trans-Blot SD型半干转转膜仪(Bio-Rad company 美国)；F3型全自动荧光与可见光凝胶成像分析系统(Syngene company，英国)；氯仿(安徽时联特种溶剂股份有限公司)；异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；PCR引物(武汉金开瑞生物工程有限公司)。

1.3 模型制备

肝郁脾虚型抑郁症模型的建立参照相关文献[3]。大鼠每日随机进行以下6种刺激中的任意1种，对其进行刺激以建立慢性不可预见性应激模型：①禁食、禁水12 h；②昼夜颠倒；③45℃高温热水游泳致力竭时刻观察每只大鼠游泳状态；④长尾夹夹尾5 min；⑤11℃冷水游泳至力竭观察大鼠状态;⑥45°倾斜饲养12 h。每日刺激1次，每一次刺激于每天9：00进行(除昼夜颠倒从早上7点开始其余时间均为9点)，相同刺激因子不连续出现，使小鼠不能预料刺激的发生。每种刺激随机安排，累积3次，造模时间共18天。造模结束后，正常组小鼠表现无明显变化；模型组小鼠表现出神疲倦怠，对各种刺激反应减弱，喜静少动，毛发散乱无光泽，声低便溏，体重减轻等症状，初步判定肝郁脾虚抑郁模型造模成功。

1.4 预防与治疗

氟西汀预防组和艾灸预防组从第7天～18天在造模前1 h给予预防治疗。西药预防选用临床常用的抑郁症治疗药物氟西汀，按照体表面积换算法，大鼠给药浓度为0.2 mg/mL，配制药物浓度为0.2 mg/mL，灌胃量为1 mL/100 g/d。艾灸预防组选以百会、肝俞、足三里、太冲穴，在造模前1 h进行预防治疗，每柱艾灸时间为15 min。艾灸治疗组和氟西汀治疗组从成模后即第19天开始治疗，治疗时间与给药浓度同上，治疗时间为12天。

1.5 敞箱实验及糖水偏好实验

敞箱实验：每组大鼠在取材前，进行敞箱实验测试，在室内安静环境下将大鼠放置于敞箱底面的中心方格内(型号OFT-100，成都泰盟科技有限公司)，人距离敞箱1 m之外，防止惊扰大鼠。实验前，先将小鼠放置于板上适应2 min。2 min后，再将小鼠重新放置于中央格，观察小鼠在5 min内爬起次数，每只大鼠测定完毕后记录结果并彻底清洁。正常组、抑郁模型组、艾灸预防组和氟西汀预防组在第19天进行观测，艾灸治疗组和氟西汀治疗组在第31天进行观测。

糖水偏好实验：在取材前3天，训练大鼠适应含糖饮水，在第1个24 h里每笼同时放置2个装有1%蔗糖的水瓶；随后24 h放置1瓶装有1%蔗糖水瓶，1瓶纯净水。最后禁食、禁水24 h，进行糖水消耗试验，动物分笼饲养，同时给予每只小鼠一瓶1%蔗糖水和纯净水，1 h后称重计算消耗量。糖水偏爱度=糖水消耗/总液体消耗×100%。

1.6 取材

正常组、抑郁模型组、氟西汀预防组和艾灸预防组，第19天预防治疗结束后，麻醉断头处死，取海马组织，用无菌EP管-80℃保存；氟西汀治疗组和艾灸治疗组治疗结束后即第31天取材。

1.7 qPCR检测大鼠海马组织CaMKⅡ mRNA表达

采用RNAiso Plus原理提取大鼠海马组织mRNA，超微量紫外分光光度计检测mRNA浓度，并反转录成cDNA(反应条件：37℃，15 min，85℃，5 s，4℃保存)，扩增反应在Applied Biosysterms 7500 Fast Real-Time PCR仪器进行(反应条件：95℃，10 min；95℃，15 s，40个循环；60℃，1 min)。扩增所需引物序列如下：CaMKⅡ F：AGCCTGAGAATCTGTTGC，R：TTCCCGTATGGGTCCTT；β-action F：CCATCTATGAGGGTTACGC，R:TTTAATGTCACGCACGATTTC。

1.8 Western Blot检测大鼠海马组织CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白含量

取出海马组织解冻并称重，取0.1 g组织放置于1.5 mL EP管中，冰上充分剪碎并研磨，加入1 mL蛋白裂解液，使其与组织充分混匀，冰上静置30 min。12000 rpm，4℃离心10 min。取上清至于新的1.5 mL EP管中，加入2×SDS 100℃变性5 min。再依据所测的蛋白浓度定量后进行凝胶电泳，蛋白上样量为50 μg/孔，半干转(25 V，1.0 mA，30 min)，5%的脱脂奶粉配合TBST溶液封闭1 h，一抗孵育(pCaMKⅡ、CaMKⅡ兔抗鼠多克隆抗体，1∶800稀释)，4℃过夜，TBST 3×10 min，二抗孵育1 h(1∶3 000稀释)，TBST 3×10 min。配置ECL化学发光液，应用全自动可见光凝胶成像分析系统曝光。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 成模评价

2.1.1 大鼠敞箱实验爬起次数 如表1所示，与正常组相比，抑郁模型组大鼠爬起次数明显减少(P<0.05)；与抑郁模型组相比，艾灸预防组、氟西汀预防组、艾灸治疗组、氟西汀治疗组大鼠爬起次数均明显增多(P<0.05)；与艾灸预防组相比，艾灸治疗组大鼠爬起次数明显减低(P<0.05)。

表1 艾灸对各组大鼠爬起次数与糖水偏好的影响

注：与正常组比较，*P<0.05；与抑郁模型组比较，#P<0.05；与艾灸预防组比较，△P<0.05

2.1.2 大鼠糖水偏好情况 如表1所示，与正常组相比，抑郁模型组大鼠糖水偏好程度明显减少(P<0.05)；与抑郁模型组相比，艾灸预防组，氟西汀预防组，艾灸治疗组，氟西汀治疗组糖水偏好程度均明显增多(P<0.05)；与艾灸预防组相比，艾灸治疗组大鼠糖水偏好程度明显降低(P<0.05)。

2.2 大鼠海马组织CaMKⅡ mRNA表达

如表2所示，与正常组相比，抑郁模型组大鼠CaMKⅡ mRNA表达明显降低(P<0.05)；与抑郁模型组相比，艾灸预防组、氟西汀预防组、艾灸治疗组、氟西汀治疗组大鼠mRNA表达均明显增多(P<0.05)；与艾灸预防组相比，艾灸治疗组大鼠mRNA表达明显降低(P<0.05)。

表2 艾灸对各组大鼠海马组织CaMKⅡ mRNA表达影响

注：与正常组比较，*P<0.05；与抑郁模型组比较，#P<0.05；与艾灸预防组相比，△P<0.05

2.3 大鼠海马组织CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白含量

如图1、表3所示，与正常组相比，抑郁模型组大鼠CaMKⅡ蛋白表达明显降低(P<0.05)，且p-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值明显降低(P<0.05)，蛋白磷酸化过程被抑制；与抑郁模型组相比，艾灸预防组、氟西汀预防组、艾灸治疗组、氟西汀治疗组大鼠CaMKⅡ蛋白表达明显均明显增多(P<0.05)且p-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值明显增加(P<0.05)，促进CaMKⅡ蛋白磷酸化过程；与艾灸预防组相比，艾灸治疗组大鼠蛋白表达及其磷酸化比例均明显降低(P<0.05)。

图1 艾灸对各组大鼠海马组织CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表达影响

组别nCaMKⅡ/β-actinp-CaMKⅡ/CaMKⅡ正常组120.77±0.010.72±0.02抑郁模型组120.28±0.01*0.50±0.03*艾灸预防组120.98±0.03*#0.83±0.04*#氟西汀预防组120.77±0.01#△0.73±0.01#△艾灸治疗组120.77±0.01#△0.69±0.01#△氟西汀治疗组120.97±0.01*#0.77±0.04*#△

注：与正常组比较，*P<0.05；与抑郁模型组比较，#P<0.05；与艾灸预防组比较，△P<0.05

3 讨论

抑郁症病名属于现代医学名词，归属于中医的“郁病”“百合病”等范畴内，病位在脑，又与肝、心、脾等多个脏腑密切相关，情志过及为此病发病的主要病因，情绪的变化最易使气机不畅，肝失疏泄，进而使肝气郁结，肝郁或久病久劳久虑多伤及脾脏，致使气血生化乏源引发疾病的发生[4]，本研究采用肝郁脾虚模型大鼠，采用艾灸疏肝解郁疗法进行预防治疗。拟部分阐释疏肝健脾法指导艾灸选穴对肝郁脾虚型抑郁大鼠作用机制。百会位于巅顶，内通于脑为手足三阳经与督脉及足厥阴肝经之会，位居头之巅顶，犹天之极星居北，为百脉聚会之处，可调补中气、健脑宁神，是宁心调神之要穴。太冲穴为足厥阴肝经的腧穴且为肝经原穴，“五脏有疾，当取之十二原”，同时太冲穴为肝经气血流注的部位，艾灸此穴能起到调整肝经气血、疏肝解郁的目的。足三里为胃之下合穴，下合穴是六腑气血汇集于下肢阳经的穴位，它反映了手足三阳经之间经脉之气的密切联系。唐朝孙思邈从预防医学思想出发，首先提出“足三里保健灸”，又称“长寿灸”。取足三里穴，可以调理脾胃补中益气、扶正祛邪。肝俞为肝经的背俞穴，背俞穴主要治疗对应脏腑经络相联系的组织器官疾患，五脏六腑之气输注于腰背部的俞穴，故肝俞穴是治疗肝胆疾患的要穴临床治疗抑郁症常选此穴[5]。诸穴合用，故而能够起到泻肝补脾、养心健脑安神、调畅情志之功。且选用艾灸疗法消除了可能由针刺带来的疼痛感,会有更好的临床依从性。

CaMKⅡ是一种在脑组织尤其是海马区内高度表达的蛋白酶，在神经可塑性及记忆形成中具有重要的作用。CaMKⅡ是突触后致密物的重要组成部分之一，占其蛋白总量约20%～30%，在信息传递中起关键性作用。同时CaMKⅡ是CaM通路中重要的调控指标，CaM通路对治疗抑郁症及预防抑郁症发生的发病机制起到重要作用，CaMK磷酸化可以进一步活化谷氨酸受体、活化其他离子通道，从而改变神经元的兴奋性。活化下游的CREB以调节某些蛋白的合成，改变神经元的形态、突触的数量及结构。在突触可塑性和学习记忆中发挥着关键作用[6-7]。有研究证实，神经激肽Ⅰ受体基因敲除小鼠可以显示出类似于动物长期用抗抑郁剂治疗后的行为反应，在其前额皮质、海马和纹状体中均可见到明显的CaMKⅡ磷酸化反应[8]。对接受治疗的重度抑郁症患者的单核苷酸多态性基因型分析及基因-环境交互作用分析发现，CaMKⅡ磷酸化是治疗药物产生抗抑郁作用的重要作用机制之一[9]。

本实验研究结果表明，艾灸无论在治疗肝郁脾虚型抑郁症还是预防抑郁症的发生发展过程中均具有明显的作用。其预防及治疗机制可能是通过激活大鼠海马组织CaMKⅡ基因表达，进而促进CaMKⅡ蛋白磷酸化，最终达到预防及治疗抑郁证的作用。

艾灸防病保健作用在古代文献中多有记载，是中医“治未病”常用方法之一。目前，在“治未病”思想指导下的艾灸应用在多个领域方面已展现出明显的效果。防病重于治病。在“治未病”思想指导下是用艾灸合理选穴，将理论与实际相结合，则能充分发挥艾灸的预防与治疗作用。实验研究证实，艾灸预防抑郁症的发生发展过程比艾灸直接治疗抑郁症具有更确切的效果，本实验研究部分阐释了艾灸现代作用机理，也为临床工作者预防及治疗抑郁症提供了新的诊疗思路。

[1] 尹冬青，田金洲，时晶，等.15196例抑郁症中医证候及证候要素特点的文献研究[J].中华中医药学刊,2013(2):279-282

[2] 徐春燕，田金洲，时晶，等.抑郁症的中医证候特征研究[J].中华中医药学刊,2013(4):810-813

[3] 陈小野.实用中医证候动物模型学[M].北京:中国协和医科大学,1993

[4] 刘庆宪，马晓玲.抑郁症相关情志疾病论析[J].中华中医药学刊,2010(4):866-867

[5] 孙华，赵慧，张捷，等.针刺百会、足三里对抑郁症患者血清炎性细胞因子水平的影响[J].中国针灸,2010(3):195-199

[6] Hell JW.CaMKII:claiming center stage in postsynaptic function and organization[J].Neuron,2014,81(2):249-265

[7] Coultrap SJ,Bayer KU.CaMKII regulation in information processing and storage[J].Trends Neurosci,2012,35(10):607-618

[8] Musazzi L,Perez J,Hunt SP,et al.Changes in signaling pathways regulating neuroplasticity induced by neurokinin 1 receptor knockout[J].Eur J Neurosci,2005,21(5):1370-1378

[9] Shi Y,Yuan Y,Xu Z,et al.Genetic variation in the calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CaMK) pathway is associated with antidepressant response in females[J].J Affect Disord,2012,136(3):558-566

MoxibustionInterventiononHippocampalCaMKIIExpressioninDepressionRatswithLiver-qiStagnationandSpleen-qiDeficiency

ZHANG Miao, LIU Hui-hui, DONG Bao-qiang, LI Rui-jie, ZHANG Xiao-qing△

(LiaoningUniversityofTCM,Shenyang110847,China)

Objective：To investigate the effect of moxibustion on calmodulin kinase II (CaMK II) of the calmodulin signaling pathway in the hippocampus of rats with depression, and to explain the mechanism of moxibustion treatment for depression of liver-qi stagnation and spleen-qi deficiency.Methods72 Wistar rats(male, 150±20 g) were randomly divided into the blank control group(group A), the depression model group(group B), the moxibustion prevention group(group C), the Fluoxetine prevention group(group D), the moxibustion treatment group(group E) and the Fluoxetine treatment group(group F), with 12 rats in each group. The rats were fed adaptively for one week before modeling, group C and group D were given preventive treatment one hour started from 7th to 18th day; group E and group F were intervened from 19th to 31rd day after modeling. CaMK II expression of the hippocampus was detected by qPCR, and the expressions of CaMK II and its phosphorylated protein were detected with WB method.ResultsCompared to group A, expressions of CaMK II and its protein phosphorylation were significantly decreased in group B; they were greatly increased in group C, group D, group E, and group F after intervention; the levels of CaMK II and its protein phosphorylation were obviously lower in group E than those in group C.ConclusionMoxibustion can specifically increase the expression of CaMK II of hippocampus in rats with liver-qi stagnation and spleen-qi deficiency, and promote the phosphorylation of CaMK II protein, which plays a significant role in the treatment and delaying the development of depression, and preventive treatment of moxibustion has an obvious advantage in the prevention of depression under the guidance of “preventive treatment of disease”.

Moxibustion; Depression; Pattern of liver-qi stagnation and spleen-qi deficiency; CaMK II; Protein phosphorylation

R246.6

A

1005-0779(2017)12-0069-04

辽宁省科技厅博士启动基金,编号:201501095。

张淼(1991- )，女，2015级针灸推拿专业硕士研究生。

△

张小卿(1979- )，女，副教授，硕士研究生导师,主要从事针灸机理研究。

2017-07-22