风车子抑素A4对人脐静脉内皮细胞的抑制增殖与诱导自噬作用研究

黄泽智，蒋传命，苏 敏，覃熙媛，罗志勇

(1.邵阳学院 医学检验学院，湖南 邵阳，422000；2.中南大学 分子生物学研究中心，湖南 长沙，410000)

风车子抑素A4对人脐静脉内皮细胞的抑制增殖
与诱导自噬作用研究

黄泽智1，蒋传命1，苏 敏2，覃熙媛2，罗志勇2

(1.邵阳学院 医学检验学院，湖南 邵阳，422000；2.中南大学 分子生物学研究中心，湖南 长沙，410000)

目的研究自噬在风车子抑素A4(Combretastatin A4，CA4)抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖中的作用，探讨CA4抑制血管生成的机制。方法体外培养HUVECs，采用不同浓度的CA4处理HUVECs，药物作用不同时间后用MTT法检测CA4对细胞存活率的影响，MDC染色检测10nM CA4处理不同时间自噬小体变化的情况，RT-PCR检测自噬相关基因LC3B和Beclin 1基因转录水平的变化，Western Blot检测LC3B和Beclin1的蛋白表达水平的变化。结果CA4能抑制HUVECs增殖并在一定范围呈浓度依赖性和时间依赖性；10nM CA4处理12小时和24小时自噬小体显著增加，诱导HUVECs自噬；荧光定量PCR结果显示自噬相关基因LC3Ⅰ表达下调、LC3Ⅱ表达上调，LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值显著上调，Beclin 1表达上调；Western Blot结果与荧光定量PCR结果一致，但mTOR蛋白未见明显变化。结论CA4能显著抑制HUVECs增殖和诱导HUVECs自噬。

风车子抑素A4;自噬;内皮细胞

血管生成(angiogenesis)是指从已经存在的毛细血管或毛细血管后静脉发展形成新的血管的过程，它与内皮细胞增殖、迁移、侵袭等过程密切相关。血管生成与肿瘤的发生、发展、转移关系密切，肿瘤细胞在缺氧环境下分泌促血管生成因子，刺激内皮细胞增殖生长，从而使肿瘤内血管新生。许多生物学过程都可成为抗肿瘤药物作用的靶点，如抑制细胞的增殖、诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞的信号转导、抑制肿瘤血管生成等，其中抑制血管生成已成为抗肿瘤研究的重要方向[1]。

风车子抑素(Combretastatin)系列化合物是由学者Pettit从风车子属南非柳树Combretum caffrum树皮中分离得到，包括17种结构相似的化合物，其中风车子抑素A4(Combretastatin A4,CA4)的活性最强。CA4的基本结构为A、B两个苯环经顺式乙烯桥连接，苯环上有一些甲氧基基团。CA4结构式如图1所示，CA4是新型的微管蛋白秋水仙碱位点结合剂，目前正在进行Ⅲ期临床试验，应用前景十分看好。

图1CA4的结构

Fig.1StructureofCA4

细胞自噬(autophagy or autophagocytosis)又称为Ⅱ型细胞死亡，是细胞在自噬相关基因(autophagy related gene，Atg)等调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。 近十多年来的研究显示，自噬作为一种高度保守的适应机制，在肿瘤细胞中被保留下来，在肿瘤发生、发展的不同阶段，自噬可能起着不同的作用。在肿瘤治疗过程中发现了一些因素能引起细胞自噬，尽管适度的自噬能促进细胞存活，但自噬样死亡经常被观察到。因此，如何促进细胞进入“自噬样死亡程序”，成为肿瘤治疗研究的新热点。目前，关于自噬在CA4抑制血管内皮细胞增殖中的作用报道较少，本研究以人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为对象，初步探讨自噬在CA4抑制内皮细胞增殖中的作用。

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1 材料与方法

1.1 细胞

HUVECs购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

MDC染色经荧光显微镜观察结果显示，经10nM CA4处理的HUVECs细胞核周围区域阳性染色，呈点状结构，随着作用时间的增加，MDC染色细胞数目逐渐增多，每组统计100个细胞，计算点状聚集MDC荧光的细胞比例，实验重复三次，求平均值与标准差。各时间点(0、6、12、24h)的自噬细胞比率分别为(5.36±0.25)%、(9.38±0.18)%、(20.31±0.41)%、(28.45±0.34)%。与对照组相比，12h、24h处理组细胞自噬显著增多(p<0.05)。24h处理组细胞自噬率达到最大值，与对照组相比显著增多(p<0.01)，见图3。

收集不同浓度CA4(0、5、10、20nM)处理24h的HUVECs细胞，加入细胞裂解缓冲液中提取蛋白(按试剂盒操作说明书进行操作)。测蛋白总浓度，各取30μg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，按Western Blot方法，电转移至硝酸纤维素膜，以封闭液(5%脱脂奶粉)封闭，0.1%TTBS清洗后，分别加入一抗，于4℃温育2h。抗体按照说明书以1∶1 000稀释。加入稀释二抗工作液，于室温温育2h。进行显影，Image Lab软件对目的条带以全自动图像分析系统进行定量分析，计算其积分吸光度，以与内参GAPDH吸光度值之比反映各基因蛋白质表达水平的改变。

1.2 材料

1.3 细胞培养

收集10nM CA4处理不同时间(0、6、12、24h)的HUVECs细胞，PBS清洗2次，除去培基，4%多聚甲醛固定15min，加入50μM MDC染色，37℃温育60min，PBS清洗2次，荧光显微镜下观察。每组统计100个细胞，计算含自噬细胞的比例。

1.4 CA4对HUVECs细胞增殖的检测

取对数生长期的HUVECs细胞，按5×103/孔接种到96孔板中，每孔加入200μl培养基，于孵箱中培养24小时，将细胞分为空白对照组、加药组(0、5、10、50、100nM)，每组设5个复孔，分别作用12、24、48、72h，加入MTT 20μl(5g/ml)，继续培养4h，弃去孔内培养液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min于570nm波长处用酶标仪测各孔吸光度A，重复实验三次，取平均值与标准差。

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1.5 CA4对HUVECs细胞自噬的影响

用含10%小牛血清的DMEM培养基于37℃、5%CO2、95%饱和湿度培养，取对数生长期细胞用于实验。

两年后，老板终于松口，答应放李高明回家，条件是他必须做到春节前。李高明高兴，但他没有日历、手表，靠什么算日子呢？李高明看着工地旁的包谷地，估摸着等包谷收完了，再过一段时间，他应该就能回去了。“真的是看着那个包谷地过，等着时间回家。”

1.6 CA4对HUVECs细胞自噬相关基因表达的影响

收集不同浓度CA4(0、5、10、20nM)处理24h的HUVECs细胞，加入1ml Trizol试剂，提取细胞总RNA。采用invitrogen M-MLV cDNA合成试剂盒进行cDNA合成。合成体系为总RNA 1μl，Oligo(dT)1μl，双蒸水10μl，dNTP 混合物(10mmol·L-1)2μl，RNase抑制剂1μl，逆转录酶1μl，5×Reaction buffer 4μl，总体积20μl。以合成的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系为：cDNA模板 1μl， dNTP 混合物(10mmol·L-1)1μl，上游引物(20μmol·L-1)1μl，下游引物(20μmol·L-1)1μl，2× Μltra-SYBR Mixture(With ROX)8μl，双蒸水8μl，总体积20μl。扩增反应程序为：95℃预变性10min，然后以94℃30 s，60℃45 s，72℃1min的程序循环35次，72℃延伸10min。PCR引物序列(Premier sequence)5.0软件设计(见表1)。以GAPDH为内参对照，用下表1中引物进行Real-time PCR扩增，每个样品重复3次。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，基因表达水平的差异采用公式2-△△Ct计算。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.7 CA4对HUVECs细胞自噬相关蛋白表达的影响

MSU晶体的生长速率取决于尿酸盐离子的浓度[9]。研究[8]发现，在温度和尿酸盐浓度保持恒定时，晶体长度与时间呈线性关系；当尿酸盐浓度升高时，晶体生长速率随之加快。该研究进一步在生理pH值、温度、Na+浓度下发现，尿酸盐离子浓度小于4 mmol/L时，MSU晶体出现溶解现象；尿酸盐离子浓度为4 mmol/L时，晶体保持稳定；尿酸盐离子浓度为4～8 mmol/L时，晶体持续生长[8]。

1.8 统计学分析

CA4由中南大学湘雅医学院药学院馈赠，溶剂采用DMSO，贮存母液浓度为10mM。DMEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；青链霉素购自杭州四季青公司；0.25%胰蛋白酶购自Hyclone公司；MTT、DMSO试剂购自Sigma-Aldrich公司；小分子量蛋白Marker购自Fermentas公司；PVDF膜购自Millipore公司；Western blotting化学发光试剂盒购自Invitrogen公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Pierce公司；Beclin1抗体、LC3 Ⅱ抗体均购自英国Abcam公司，invitrogen M-MLV cDNA合成试剂盒购自杭州沃森生物科技公司等。

2 结果

2.1 CA4对HUVECs细胞增殖的影响

MTT实验结果显示，不同浓度的CA4分别处理HUVECs细胞12、24、48和72h ，根据测得各组A值，计算细胞存活率。结果显示5、10、50、100nM CA4对HUVECs细胞处理24h均有抑制作用，且抑制率呈明显的剂量依赖效应，随着时间的延长，抑制效应增加，不同浓度之间有显著差异。当CA4作用于HUVECs细胞48h后，测得的半数抑制浓度(IC50)约为10nM，见图2。

图2 CA4抑制内皮细胞的增殖Fig.2 CA4 inhibited cell proliferation of HUVECSCell proliferation was determined by MTT assay after being treated with different concentration CA4 at varying times(12,24,48 and 72h).All data were represented as means±SD,n=3

2.2 CA4对HUVECs细胞自噬的影响

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图3 CA4对HUVECs细胞自噬的影响Fig.3 The inducing effect of CA4 on autophagy of HUVECsA、B、C、D stand for the number of autophagosomes treated with 10 nM CA4 at different times(0、6、12、24h)

2.3 CA4对HUVECs细胞自噬相关基因mRNA的影响

荧光定量PCR结果显示，用不同浓度CA4(0、5、10、20 nM)分别处理24h，计算各组HUVECs细胞中自噬相关基因在转录水平与内参基因GAPDH的比率。结果显示10nM CA4处理组LC3Ⅱ基因与对照组相比显著增高(p<0.05)，LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比值各药物处理组都显著增加。各组beclin1 mRNA转录水平与对照组比较均存在显著性增高，具有统计学意义(p<0.05)。mTOR基因表达则未见明显变化(结果见表2)。

Western Blot结果，以目的蛋白与内参GAPDH的荧光积分度比值表示蛋白表达量，不同浓度CA4处理组的LC3B、Beclin1蛋白表达均下降，各加药组与对照组之间差异均有统计学意义(p<0.05)；20nM组与对照组比较，差异非常显著(p<0.01)，且蛋白表达量呈剂量依赖性下降。蛋白电泳图谱显示，结果与荧光定量PCR结果相一致。但mTOR蛋白未见明显变化，见图4。

表2 不同浓度CA4处理HUVECs细胞自噬相关基因mRNA变化(%±SD，n=3)Table 2 The change of mRNA,the HUVECs autophagy-related gene, treated by CA4 of different concentration

注：“*”表示p<0.05。

2.4 CA4对HUVECs细胞自噬相关蛋白的影响

如果说“宗经”是运行《文心雕龙》的第一条枢轴，属于显性的，那么该书还有第二条枢轴存在，它隐默地支撑着全书的结构。线索来源于刘勰自述全书体系的末尾句，即“位理定名，彰乎大易之数，其为文用，四十九篇而已”。该句比照《易传·系辞》“大衍之数五十，其用四十有九”之说，王弼注云：“演天地之数所赖者曰五十也，其用四十有九，则其一不用也。不用而用以之通，非数而数以之成，斯易之太极也。”[注]孔颖达：《周易正义》，台北：艺文印书馆，2007年，第152页。

图4 CA4对自噬相关蛋白表达的影响Fig.4 The inducing effeot of CA4 on the expression of HUVECs autophagy-related proteinsThe expression result of autophagy-related proteins caused by CA4 of different concentration(0、5、10、20nM)treating HUVECs

3 讨论

血管生成过程主要依赖于毛细血管内皮细胞的迁移、增殖和管腔的形成。肿瘤组织能通过肿瘤细胞分泌促血管生成因子，刺激内皮细胞排列成血管。血管生成对肿瘤的生长具有重要作用。血管生成抑制剂既可以直接作用于内皮细胞，抑制内皮细胞的功能，也可以间接作用于肿瘤细胞。近年来，抑制血管生成的研究成为抗肿瘤药物研发的重要方向，传统的抗血管生成主要通过抑制血管生长因子的产生、抑制血管生长因子的活性，调节生长因子受体的活性，抑制内皮细胞的增殖、迁移及分化为新生血管等机制来发挥作用[1]。大量临床前数据表明，CA4具有广谱的体外抗肿瘤活性，其抗肿瘤作用是通过破坏血管形成[2]。我们的前期研究证实CA4通过VEGF/VEGFR2信号途径而发挥抗肿瘤血管生成的作用。此外，研究表明CA4对多药耐药株也有明显的抑制细胞增殖的作用，风车子抑素类化合物在过表达BCRP的肿瘤细胞中也展示了潜在的活性[3]，这些研究为CA4与其它肿瘤药物的联合应用提供重要基础。

自噬是真核细胞降解其内容物，以实现细胞自身的代谢需求和某些细胞器的更新，是细胞的防御机制和生存机制，也是细胞死亡的方式之一。自噬在许多有机体的各种生理过程中起着重要的作用，包括应激反应、肿瘤抑制、细胞内蛋白和细胞器的质量控制等[4,5]。

肿瘤细胞在代谢压力、缺氧、营养缺乏及抗肿瘤治疗等恶劣的细胞外环境下表现出抗凋亡活性，肿瘤细胞在这样艰难的环境中生存，自噬起着关键性的作用[6]。自噬的激活能刺激死亡或通过促生存途径来响应化疗引起的刺激，通常，促生存作用更明显。通过抑制自噬可以增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性[7]。抗血管生成治疗产生的缺氧和饥饿导致的肿瘤细胞自噬也能调节肿瘤耐药性和生存。Li等报道，JNK-Bcl-2信号途径与CA4诱导的肿瘤细胞自噬相关：抑制JNK的活性能抑制自噬，并促进CA4诱导的细胞死亡；用Bcl-2抑制剂直接阻断自噬通路同样能促进CA4诱导的细胞死亡[8]。

风车子抑素类化合物是血管破坏剂，并能造成促进促生存的自噬发生的环境，在CA4治疗的肿瘤中能通过电子显微镜观察到自噬的发生，但是自噬在这些肿瘤中的作用还不是很明确[9]，它与自噬抑制剂的联合应用效果有待进一步的临床研究。

本研究通过MTT实验检测了CA4对HUVECs细胞的增殖抑制效应，并观察到CA4处理的HUVECs细胞经MDC染色出现明显的自噬泡增多现象，LC3B和Beclin1的mRNA和蛋白质水平的结果显示自噬增强现象，这表明CA4明显诱导HUVECs细胞自噬增强。因此，CA4不仅能诱导肿瘤细胞的自噬，也能诱导HUVECs细胞的自噬发生。自噬可能在CA4抑制HUVECs细胞的增殖过程中发挥重要的作用，自噬亦可能参与肿瘤血管生成。抑制自噬是否会增强抗肿瘤药物的敏感性，血管生成抑制剂与自噬抑制剂的联合使用是否会有更好的效果，联合使用是否减低血管生成抑制剂的细胞毒性，这些问题有待进一步探讨。

本研究发现CA4诱导HUVECs细胞自噬增强现象，为CA4与自噬抑制剂的联合用药提供了初步的思路和实验依据，但仍有很多问题需要进一步研究。

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StudyontheProliferationInhibitionandAutophagy-inducingEffectsofCombretastatinA4onHumanUmbilicalVeinEndothelialCells

HUANG Zezhi1, JIANG Chuanming1, SU Min2, QIN Xiyuan2, LUO Zhiyong2

(1.School of Medical Laboratory, Shaoyang University, Shaoyang 422000, China;(2.Research Center of Molecular Biology, Central South University, Changsha 410000, China)

combretastatin A4;autophagy;endothelial cells

1672-7010(2017)06-0090-07

Q786

A

2017-09-18

湖南省教育厅科学研究项目(15C1465);湖南省教育厅优秀青年项目(15B220)

黄泽智(1964-)，男，湖南新宁人，教授，主要从事生物化学与分子生物学研究;E-mail:huangzz1964@163.com

Received：ObjectiveTo investigate the role of autophagy in the proliferation inhibition effect of Combretastatin A4(CA4) on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), and to explore the mechanism of angiogenesis inhibition.MethodsHUVECs were cultured in vitro and treated with different concentration of CA4. The effect of CA4 on cell survival rate was determined by MTT method after a varying period of time,the treatment effect of 10nM CA4 on autophagosome at different time was determined by Monodansylcadaverin(MDC) staining methods,the genetic transcription level changes of autophagy-associated genes, LC3 and Beclin 1, were determined by Real Time PCR,the protein expressionlevel changes of LC3 and Beclin 1 were detected by Western Blot.ResultsCA4 can inhibit the proliferation of HUVECs,the inhibition depends on concentration and time in certain range,the autophagosomes treated by 10nM CA4 for 12 hours and 24 hours increased significantly, inducing autophagy in HUVECs cells,the results of real time PCR showed that the expression of LC3Ⅰ, the autophagy-related gene, was down-regulated, the expression of LC3 Ⅱ was up-regulated, the LC3Ⅰ to LC3 Ⅱ ratio was significantly up-regulated and the expression of Beclin 1 was up-regulated,the results of Western Blot was the same as that of real time PCR,but there was no obvious changes in the expression of mTOR protein.ConclusionCA4 can inhibit the proliferation of HUVECs significantly and induce the autophagy of HUVECs.