薄层色谱法和高效液相色谱法在白藜芦醇胶囊定性定量研究中的应用

贾文斌，钱 跹，吕 磊

·基础医学·

·论著·

薄层色谱法和高效液相色谱法在白藜芦醇胶囊定性定量研究中的应用

贾文斌，钱 跹，吕 磊

目的建立保健食品白藜芦醇胶囊的定性定量检测方法，为完善其质量标准提供科学依据。方法对白藜芦醇胶囊中的主要成分白藜芦醇采用薄层色谱法(TLC)进行定性鉴别，采用高效液相色谱法(HPLC)进行定量分析，实验采用Hedara ODS柱；以甲醇∶水= 40∶60为流动相；柱温：30 ℃；流速：1 ml/min；用紫外检测器于306 nm处检测。结果TLC鉴别中白藜芦醇的斑点清晰；白藜芦醇浓度在5.02～100.40 μg/ml时，浓度和峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9)；加样回收率为99.38%～102.70%；最低检出浓度为50 μg/ml。方法的精密度良好，RSD为0.59%(n=6)。结论该研究所建立的定性定量检测方法快速、简便、准确、灵敏度高，适用于白藜芦醇的定性定量研究，可实现对白藜芦醇胶囊的质量控制。

薄层色谱法；高效液相色谱法；白藜芦醇胶囊；定性定量研究

白藜芦醇(resveratrol,3,4′,5-三羟基二苯乙烯)是一种含有芪类结构的多酚化合物，广泛存在于葡萄、虎杖、花生等天然植物或果实当中[1]。到目前为止，至少已在21科、31属的72种植物中发现了白藜芦醇。研究表明，白藜芦醇能够阻止低密度脂蛋白的氧化,具有潜在的防治心血管疾病、防癌、抗病毒及免疫调节作用,其作用主要是由于它的抗氧化特性，能抑制血小板聚集，减少心脏病的发生和控制其发展;还有抗菌、抗衰老作用[2-4]。近年来,美国天然药物研究所(CNN)研究发现，白藜芦醇具有抗艾滋病的作用[5]。由于这些作用比较明显，白藜芦醇已被喻为继紫杉醇之后又一新的绿色抗癌药。人们对其关注和研究越来越广，现已将白藜芦醇植物提取物作为食品添加剂使用或者制成具有降脂、美容、减肥和抗癌作用的天然保健食品及胶囊。但目前对白藜芦醇的测定还没有统一的标准，提取方法也各式各样，目前白藜芦醇的定量测定最常见的方法有：一阶导数光谱法、高效液相色谱法(HPLC)、薄层扫描法、紫外分光光度法、气相色谱/质谱法、毛细管电泳法、电化学发光法等[6]。本文建立了HPLC法测定胶囊中白藜芦醇含量的方法，可用于白藜芦醇胶囊的质量控制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器 Shimadzu LC-2010 C液相色谱仪；KQ-250DE型超声仪(昆山市超声仪有限公司)；BS 21 S万分之一分析天平(德国Satorius公司)；PL5242纯化水制备系统(美国PALL公司)；1621-1型高速离心机(上海医疗器械有限公司手术器械厂)；薄层硅胶GF254板。

1.2 试药 白藜芦醇(批号：111535-201703)由中国食品药品检定研究院提供，纯度>98%。甲醇和乙腈均为色谱纯(购自美国Merck公司)，氯仿、丙酮为色谱纯(购自SIGMA公司)，水为超纯水。白藜芦醇胶囊供试品，规格：0.3 g/粒，90粒/瓶，批号：20161002，20161221，20170111，市售。

1.3 对照品与供试品溶液的制备 精密称定白藜芦醇对照品25.1 mg，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.502 mg/ml标准品溶液。取20粒胶囊，去壳取内容物，混合均匀后称定20.0 mg，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解，30 ℃超声提取30 min，冷却，加甲醇定容至刻度，摇匀，静置后取2 ml于离心管中(12 000 r/min，离心半径8 cm)离心10 min，取上清液以0.45 μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液。

1.4 薄层色谱法(TLC)鉴别 取供试品和对照品溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶丙酮=2∶1为展开剂，展开，取出，晾干，于360 nm处观察荧光。

1.5 色谱条件 色谱柱：Hedara ODS柱，4.6 mm×150 mm，流动相：甲醇∶水=40∶60，柱温：30 ℃，流速：1.0 ml/min，紫外检测波长：306 nm，进样量：20 μl。

1.6 专属性 分别取甲醇溶液和样品溶液20 μl进样分析，记录色谱图溶剂峰后主成分峰保留时间的3倍。(1)标准曲线：将对照品溶液进行逐级稀释,配制成浓度分别为100.40、80.32、50.20、25.10、10.04、5.02 μg/ml，系列对照品溶液，每个浓度点平行进样3次，以对照溶液浓度(X)为横坐标，色谱峰面积值(Y)为纵坐标进行线性回归。(2)定量限和检测限。将供试品溶液多次稀释直至测定主峰峰高为基线噪声的10倍和3倍左右。

1.7 精密度 取低中高3个浓度(10.04、50.20、100.40 μg/ml对照品溶液)20 μl进样，重复测定6次，记录峰面积，考察日内精密度。

1.8 重复性 取同一批号的胶囊内容物，按供试品溶液制备过程测定，代入标准曲线计算含量，平行测定6次。

1.9 稳定性 将供试品溶液分别于0、2、4、6、8、10 h取20 μl注入高效液相色谱仪，记录峰面积。

1.10 加样回收率 取白藜芦醇样品约10.0 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，配制浓度为1.07 mg/ml白藜芦醇标准品溶液，精密量取溶液0.6 ml、1.0 ml、1.4 ml加至样品溶液中，按样品溶液配制过程处理，配制成浓度水平为80%、100%、120%的的供试溶液各3份。测定含量，计算回收率。

1.11 样品含量测定 取3个批号白藜芦醇胶囊各20粒，去壳取内容物，混合均匀，称定本品约20 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，按供试品溶液进行制备，进样20 μl，记录色谱峰面积。

2 结果

图1 白藜芦醇胶囊中白藜芦醇薄层鉴别结果

2.1 TLC鉴别 360 nm处观察荧光。如图1所示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应斑点位置处，显相同颜色的斑点。

2.2 专属性 白藜芦醇保留时间为11.908 min，空白对照无干扰并且白藜芦醇主峰能与各杂质得到较好的分离，色谱图见图2。(1)标准曲线：线性方程：y=6.352 4x+1.387，r=0.999 9，结果表明，白藜芦醇在该浓度范围内线性关系良好。(2)定量限和检测限：结果显示本方法的定量限和检测限分别为50 ng/ml和18 ng/ml。

图2 白藜芦醇胶囊中白藜芦醇专属性结果

2.3 精密度 3个批号20161002、20161221、20170111的精密度分别为1.64%、2.10%、1.38%，表明该方法的精密度较高。

2.4 重复性 结果示样品平均含量10.52%，3个批号基本一致，RSD为2.24%，重复性较好。

2.5 稳定性 结果表明RSD为2.36%，样品溶液在10 h内稳定性良好。

2.6 加样回收率 各样品量回收率平均(100.58±1.84)%，结果见表1。

表1 白藜芦醇胶囊中白藜芦醇回收率试验结果

2.7 样品含量测定 3个批号白藜芦醇胶囊HPLC法含量测定分别为10.06%、11.13%和10.59%。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 精密称定白藜芦醇对照品25.1 mg，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.502 mg/ml标准品溶液，经逐级稀释得浓度为4 μg/ml 溶液，经紫外扫描，记录光谱图。结果表明：本品在306 nm处有最大吸收。

3.2 色谱条件的选择 经过文献查阅，流动相主要采用乙腈-水系统，由于样品处理过程中采用的溶剂是甲醇溶液，且甲醇成本较低，毒性较小，故考虑采用甲醇-水系统代替乙腈-水系统作为流动相。由于白藜芦醇的结构中含有3个羟基，故考虑采用甲醇-水-甲酸系统流动相以及甲醇-水-磷酸盐系统作为流动相。实验结果表明，峰形并未得到明显的改善。通过以上摸索，确定流动相采用甲醇-水系统，不断调整流动相比例至甲醇∶水=40∶60时，色谱峰保留时间合适，峰形良好。

3.3 样品前处理方法的选择 由于前期预实验药品含量测定重复性不高，经过对实验过程的反复研究，发现超声这一步骤中存在很多影响提取的因素：超声温度、超声加入甲醇的体积、超声时间、避光操作等。该胶囊为中药类，故超声温度对内容物的提取存在较大影响，实验操作中严格超声仪水温在30 ℃，以保证每批样品处理的平行性。超声过程加入甲醇溶液的体积对内容物提取也有较大影响，实验操作中保持每份内容物准确加入25 ml甲醇。超声时间是对提取过程影响最大的一个因素。初步文献查阅，超声时间为20 min。实验过程中，称取6份胶囊内容物，精密称定后，加甲醇25 ml溶解，各取2份超声20、30、40 min后，按2供试品溶液制备过程自“冷却，加甲醇定容至刻度”开始配置供试品溶液，进样，结果表明，超声30 min比20 min对内容物提取有较大的提高，而40 min比30 min提高不明显，故确定内容物提取超声时间为30 min。

相关文献表明，白藜芦醇见光和热较不稳定，故实验操作过程中需特别注意避光，以保证实验结果的准确性。

[1] Perrone D, Fuggetta M P, Ardito F, et al. Resveratrol (3,5,4′-trihydroxystilbene) and its properties in oral diseases[J]. Experimental and Therapeutic Medicine, 2017, 14(1): 3-9. DOI:10.3892/etm.2017.4472.

[2] Abed E, Delalandre A, Lajeunesse D. Beneficial effect of resveratrol on phenotypic features and activity of osteoarthritic osteoblasts[J]. Arthritis Res Ther, 2017, 19(1): 151. DOI:10.1186/s13075-017-1365-2.

[3] Giuliani C, Iezzi M, Ciolli L, et al. Resveratrol has anti-thyroid effects both in vitro and in vivo[J]. Food Chem Toxicol, 2017, 107(Pt A): 237-247. DOI:10.1016/j.fct.2017.06.044.

[4] Zhao P, Sui BD, Liu N, et al. Anti-aging pharmacology in cutaneous wound healing: effects of metformin, resveratrol, and rapamycin by local application[J]. Aging Cell, 2017, 16(5): 1083-1093. DOI:10.1111/acel.12635.

[5] Symington B, Mapanga R F, Norton G R, et al. Resveratrol Co-Treatment Attenuates the Effects of HIV Protease Inhibitors on Rat Body Weight and Enhances Cardiac Mitochondrial Respiration[J]. Plos one , 2017, 12(1): e0170344. DOI:10.1371/journal.pone.0170344.

[6] di Donna L, Taverna D, Indelicato S, et al. Rapid assay of resveratrol in red wine by paper spray tandem mass spectrometry and isotope dilution[J]. Food Chemistry, 2017, 229: 354-357. DOI:10.1016/j.foodchem.2017.02.098.

Application of thin-layer chromatography and high performance liquid chromatography in the qualitative and quantitative research of the resveratrol capsule

JiaWenbin,QianXian,LyuLei

(FirstNavalConvalescentHospitalofQingdao,Qingdao31002,China)

ObjectiveTo establish a qualitative and quantitative detection method for the quality control of the resveratrol capsule, so as to provide scientific evidence for the perfection of the quality standards of the product.MethodsThe main ingredient of the capsule was identified by thin-layer chromatography (TLC) and was quantitatively determined by using high performance liquid chromatography (HPLC). Chromatographic separation was achieved on Hedara ODS column, with the mixture of CH3OH∶H2O=40∶60 as mobile phase, column temperature at 30 ℃, flow rate at 1ml/min and UV detection at 306 nm.ResultsTLC quality identification indicated that there were clear spots in the thin layer plate. There was a good linear relationship within the concentration of 5.02-100.4 μg/ml (r=0.999 9). Sample recovery rate was 99.38%-102.70%, and the lowest detection concentration was 50 μg/ml. With high accuracy, relative standard deviation (RSD) was 0.59% (n=6).ConclusionThe method established by the research was rapid, simple, accurate and highly sensitive, which could be used for qualitative and quantitative research of the resveratrol capsule, and also for the achievement of quality control of the resveratrol capsule.

Thin-layer chromatography; High performance liquid chromatography；Resveratrol capsule；Qualitative and quantitative research

R917

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.06.011

266071 山东 青岛，海军青岛第一疗养院(贾文斌)；第二军医大学附属东方肝胆外科医院(钱跹、吕磊)

吕磊，电子信箱：k_owen2002@126.com

2017-04-22)

(本文编辑：甘辉亮)