不同地域马齿苋多糖的总糖测定及抗氧化活性比较研究

□ 蒋妍妮 吉安市食品药品检验检测中心 黄小流 戴彩华 井冈山大学医学部

不同地域马齿苋多糖的总糖测定及抗氧化活性比较研究

□ 蒋妍妮 吉安市食品药品检验检测中心 黄小流 戴彩华 井冈山大学医学部

本文旨在探讨不同地域马齿苋多糖体外抗氧化活性及测定其总糖含量。方法：苯酚-硫酸比色法测定马齿苋多糖的总糖含量，分别采用Fenton法、DPPH法和FRAP法研究马齿苋多糖体外抗氧化活性。结果：内蒙古、安徽与河南的马齿苋多糖的总糖含量分别为14.69%，31.54%，38.17%；对羟自由基与DPPH自由基清除能力为内蒙古＞河南＞安徽，对Fe3+的还原力为河南＞内蒙古＞安徽。结论：马齿苋多糖有良好的体外抗氧化活性，多糖含量及体外抗氧化有地域性差异。

不同地域；马齿苋多糖；总糖含量；体外抗氧化活性

马齿苋（Portulaca oleracea L）为马齿苋科植物全草，又名长寿菜、蚂蚱菜、马舌菜等，可入药，也可食用；马齿苋是已在民间有较早应用历史的传统中药，目前是卫生部划定的78种药食两用野生资源之一。《本草纲目》与《滇南本草》分别记载，马齿苋有“散血消肿，利肠滑胎，解毒通淋，治产后虚汗”，“清热利湿，消炎解毒，消肿止痛”等功效；现代药理及营养学研究马齿苋有降血脂、降血糖，抗菌、抗病毒，松弛肌肉，保护血管、预防心血管疾病、抗肿瘤等药理活性，同时还有良好抗氧化、延缓衰老等营养保健作用。

有机酸、黄酮类、生物碱类、多糖、氨基酸和矿物质等是马齿苋的主要化学成分。多糖称为多聚糖（polysaccharide），结构非常复杂，它不仅是储存能量的物质，同时具有重要生物学活性如免疫调节、抗肿瘤活性、降血糖血脂等，目前已有香菇多糖、灵芝多糖、云芝多糖、黄氏多糖和猪苓多糖等应用于临床。当前对于马齿苋多糖活性的研究已有报道，吴荣昆[1]采用Fenton、DPPH及FRAP法研究发现马齿苋多糖有一定的体外抗氧化活性。植物体内糖类物质蓄积可受气候或生态环境影响，不同地域的马齿苋多糖水平在同一收获期内是否会有差异，其体外抗氧化活性有无差别有待进一步探讨，为马齿苋资源药食开发利用提供实验依据。

1 材料

1.1 材料与试剂

马齿苋全草分别采自内蒙古（赤峰）、河南（洛阳）和安徽（安庆）（2014年7月，自然晒干），经井冈山大学生命科学院许东风教授鉴定为马齿觅（Portulaca oleracea L）；DPPH（二苯代苦味肼基自由基，上海源叶生物科技有限公司）；TPTZ（2,4,6-三吡啶基三嗪，上海源叶生物科技有限公司）；D-无水葡萄糖（≥ 98%，索莱宝公司）；硫酸亚铁、无水乙醇、氯化铁、水杨酸、盐酸、丙酮、石油醚、过氧化氢、冰醋酸、无水乙醚、三水合醋酸钠等均为国产分析纯。

1.2 实验仪器与设备

LS5紫外-可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）、DU215CD电子分析天平（奥豪斯）、RE-2000A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、SHB-IIIA 循环水式多用真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）、DG160C粉碎机（浙江省瑞安市飞达药材器械厂）、GRQ-05A干热消毒箱（上海森信实验仪器有限公司）。

2 方法

2.1 马齿苋多糖的提取

结合本实验室条件及参考朱晓宦等试验方法，马齿苋干料粉碎后过40目筛，脱脂，按以下条件进行水提：料液比（1∶15，m/v）、温度100 ℃、30 min/次（热水浴回流，共4次），冷却过滤，合并滤液并旋转蒸发浓缩至约50 mL。浓缩液分次加入95%乙醇、80%乙醇进行层析，得到沉淀物后依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤后干燥备用。

2.2 马齿苋多糖的总糖测定

精确称量一定质量D-无水葡萄糖溶于重蒸馏水，定容配制成初始液，然后稀释成不同质量浓度倍数待测，采用苯酚-硫酸比色法，测得各浓度值对应的吸光值，拟合方程制作标准曲线。

2.3 羟自由基清除率

采用Fenton法[2]：取4mL Fenton工作液和2 mL待测液混匀，避光静置10 min，离心；取上清液4 mL，加入2 mL 6 mmol/L水杨酸充分混匀，避光静置30 min，于517 nm处测定吸光值。羟自由基清除率=1-(A0-A1)/A2×100%，A0为不同浓度样品的吸光值，A1为用蒸馏水替代水杨酸时测得对应浓度样品的吸光值，A2为蒸馏水替代样品时测得空白对照吸光值。

2.4 DPPH自由基清除率[3]

取5 mL 1.141×10-4mol/L DPPH工作液（70%乙醇为溶剂）和0.5 mL不同浓度的样品液混合均匀，避光静置30 min，于523 nm处测定吸光值。DPPH自由基清除率=(1-A/A0)×100%，A为样品吸光值，A0为对照样吸光值。

2.5 还原力

采用FRAP法[4]：取0.3 mL不同浓度样品和2.7 mL预热至37 ℃的FRAP工作液混合均匀，避光静置30 min，于593 nm处测定吸光值。FeSO4标准曲线的绘制：精确称取12.16 mg硫酸亚铁溶于适量的水中，加入18 mol/L硫酸0.50 mL，再加蒸馏水稀释至100 mL定容，并投入小铁钉。取上述溶液依次分别配制4 000、2 000、1 000、500、250、125、62.5 μmol/L标准溶液，绘制标准曲线。

2.6 数据处理与分析

采用Excel 2007软件进行线性及二次曲线拟合，得相关方程计算相应数据并分析。

3 结果

3.1 马齿苋多糖的总糖含量

依照2.2的方法，拟合得到标准曲线方程为：y=1.4403x-0.0461（R2=0.995），计算得出内蒙古、安徽和河南马齿苋多糖的总糖含量分别为14.69%、31.54%和38.17%。由结果可知，河南与安徽马齿苋多糖含量分别约是内蒙古的2.60倍、2.15倍，表明河南与安徽马齿苋多糖的总糖含量比较接近，内蒙古总糖含量明显低于河南与安徽的。

3.2 马齿苋多糖清除羟自由基的能力

由图1可见，马齿苋多糖对羟自由基有清除作用，随着浓度增加，清除率也增加，且呈现明显的剂量效应关系。通过对其效应关系进行二次曲线方程拟合，根据对应拟合方程计算SC50值；从表1结果可见：内蒙古、安徽和河南三地马齿苋多糖对羟自由基清除能力为内蒙古＞河南＞安徽，其中安徽对应SC50值分别约是内蒙古与河南的1.42倍和1.26倍，河南是内蒙古的1.12倍，表明三地马齿苋多糖对羟自由基清除能力有较大差异。

图1 马齿苋多糖对羟自由基的清除率与浓度关系曲线

3.3 马齿苋多糖清除DPPH自由基的能力

由图2可见，马齿苋多糖对DPPH自由基有清除作用，随着浓度增加，清除率也增加，且呈现明显的剂量效应关系。通过对其效应关系进行二次曲线方程拟合，根据对应拟合方程计算SC50值；从表2结果可见：内蒙古、安徽和河南三地马齿苋多糖对DPPH自由基清除能力为内蒙古＞河南＞安徽，其中安徽对应SC50值分别约是内蒙古与河南的1.05倍和1.02倍，三者的值相差较小，表明三地马齿苋多糖对DPPH自由基清除能力比较接近。

图2 马齿苋多糖对DPPH自由基的清除率与浓度关系曲线

表1 马齿苋多糖对羟自由基清除的SC50值

表2 马齿苋多糖对DPPH自由基清除的SC50值

3.4 马齿苋多糖还原铁离子的能力

依照2.5的实验方法，标准曲线图和结果见图3、图4、图5和图6。

从图4可见，Fe2+在593 nm处吸光值与其在62.5～4000 μmol/L浓度范围内有良好线性关系，线性方程为y=0.0003x+0.0094（R2=0.9972）。

图3 硫酸亚铁的标准曲线

图4 内蒙古马齿苋多糖还原力的FRAP值与浓度的关系线性图

图5 安徽马齿苋多糖还原力的FRAP值与浓度的关系线性图

由图5、6、7结果综合可见，不同地域马齿苋多糖都有把Fe3+还原成Fe2+能力，还原力与对应的浓度成线性关系。通过对其效应关系进行线方程拟合，根据对应拟合方程计算FRAP1000值；从表3数据显示，不同地域马齿苋多糖对Fe3+的还原能力为河南＞内蒙古＞安徽，其中安徽对应FRAP1000值分别约是内蒙古与河南的1.05倍和1.07 倍，三者的值相差较小，表明三地马齿苋多糖对Fe3+还原能力比较接近。

4 讨论

马齿苋是一年生肉质草本，性喜高湿、向阳、耐旱、耐涝，我国南北各地均常见。马齿苋分布广泛主要与其对土壤因子如有机质、全磷、全氮、全钾、铵态氮、速效钾的适应范围较宽有关，土壤因子如全磷和全氮还对马齿苋叶、茎的鲜重，植株营养物总糖、蛋白质水平影响显著；植株的总糖、黄酮含量与采摘月份有关，需提取总糖建议最佳采收期为8月中旬[15]。曲晓兰[16]分析采自泰山不同月份野生马齿苋多糖含量为9月上旬最高，陈凌[17]分析嘉兴马齿苋结果为8月＞7月＞9月，这暗示马齿苋多糖水平有地域上差异。本研究结果可见同为7月中旬采收来自内蒙古（赤峰）、安徽（安庆）和河南（洛阳）马齿苋多糖含量分别为14.69%、31.54%和38.17%。以上差异我们推测可能是安徽与河南地域比较靠近，内蒙古与上述2地相距较远，马齿苋生长的土壤因子，气候条件，光照强度等差别大导致。李香和刘跃钧分别测定贵州4地（平塘、龙里、独山和都匀），浙江丽水6地（缙云县、莲都区、龙泉市、青田县、松阳县和云和县）马齿苋多糖总量水平较接近的结果有可能是与采集地域比较接近有关[18-19]。

目前常用抗氧化活性检测方法主要基于3个方面机理，一是对反应体系中脂质氧化物抑制能力，二是对反应体系中自由基清除能力，三是对反应体系中目标氧化物的还原能力[20]。为了探究来自不同地域马齿苋多糖体外抗氧化能力及与其含量水平是否有关，我们采用Fenton、DPPH和FRAP三种方法来评价其体外抗氧化活性，羟自由基是一种能激发油脂过氧化的较强氧化剂，Fenton工作液为水溶性自由基体系；DPPH法有快捷、简便和灵敏优点，为脂溶性自由基体系；FRAP原理是基于氧化还原反应的比色法，有快速、简便和重复性好等优点[11-12]，SC50和FRAP1000分别为评价清除自由基能力与铁离子还原能力指标。由结果可知，内蒙古马齿苋多糖对羟自由基和DPPH自由基清除率能力最强，安徽的最弱；从对铁离子还原力来看，河南马齿苋多糖能力最高，安徽的最低；综合来看三地马齿苋多糖对DPPH自由基清除率、铁离子还原力比较接近；对羟自由基的清除率有较大差别。从马齿苋多糖含量与抗氧化活性关系可见，河南与安徽两地马齿苋多糖抗氧化活性与含量出现一致性结果，而内蒙古马齿苋多糖含量最低，其抗氧化能力最佳，这暗示地域相距远马齿苋的内在特性差异更大。由此我们推测不同地域尤其是相距远的地域马齿苋由于受不同地理环境，气候条件等影响，其内在的化学物在结构、性质、种类等不同而表现出外在营养活性不一样。

图6 河南马齿苋多糖还原力的FRAP值与浓度的关系线性图

表3 样品FRAP1000值与浓度关系

总之，本研究通过分析比较三个地域马齿苋多糖含量及其体外抗氧化能力，结果表明不同地域马齿苋多糖含量及抗氧化活性有差异，地域相距越远，马齿苋以上特性差异性越大，具体的相关性机理有待进一步研究。

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吉安市科技支撑项目（吉安科计字[2013]18号4）。

蒋妍妮（1977—），女，江西吉安人，本科，主管药师。研究方向：食品、药品检验检测。