病理性瘢痕成纤维细胞中凋亡因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3蛋白的表达及意义

刘启胜

(大冶市中医医院检验科 湖北 大冶 435100)

病理性瘢痕成纤维细胞中凋亡因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3蛋白的表达及意义

刘启胜

(大冶市中医医院检验科 湖北 大冶 435100)

目的：探讨病理性瘢痕成纤维细胞中凋亡因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3蛋白的表达及意义。方法：采用Western bolt技术检测46例病理性瘢痕组织、25例非病理性瘢痕组织和22例正常皮肤组织中凋亡相关因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3 的阳性表达率，并分析其相关性。结果：病理性瘢痕成纤维组织中Fas、caspase-3阳性表达率分别为21.74％、23.91％低于非病理性瘢痕的60.0％、72.0％和正常皮肤组织的86.36％、90.90％，差异有统计学意义(P＜0.05)；病理性瘢痕成纤维组织Bcl-2、survivin阳性表达率分别为78.26％、82.61％高于非病理性瘢痕的44.0％、48.0％和正常皮肤组织的13.64％、18.18％，差异有统计学意义(P＜0.05)；且非病理性瘢痕和正常皮肤组织中上述指标也存在明显差异(P＜0.05)；Spearman相关分析显示，Fas蛋白与Bcl-2蛋白、survivin蛋白表达呈负相关关系(r=-0.513、-0.629，P＜0.05)，与caspase-3蛋白表达呈正相关关系(r=0.691，P＜0.05)；Bcl-2蛋白表达与survivin蛋白表达呈正相关关系(r=0.6.16，P＜0.05)，与caspase-3蛋白表达呈负相关关系(r=-0.638，P＜0.05)，survivin蛋白表达与caspase-3蛋白表达呈负相关关系(r=-0.621，P＜0.05)。结论：病理性瘢痕成纤维组织中凋亡相关因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3的异常表达，可能参与病理性瘢痕的形成。

病理性瘢痕；成纤维组织；凋亡相关因子；表达

瘢痕是创伤修复的必然结果，但过度修复可能造成纤维细胞功能异常，引起组织良性增生，出现病理性瘢痕，进而影响局部周围组织的正常功能。目前，病理性瘢痕的机制尚未完全明确。近年来，随着细胞、分子生物学的研究进展，多数学者认为，细胞凋亡可能是病理性瘢痕的重要发病机制[1-2]。Fas是诱导细胞凋亡的重要膜蛋白分子，也是介导成纤维细胞死亡的重要通道；Bcl-2家族直接影响细胞凋亡情况，Bcl-2蛋白作为Bcl-2家族中的抗细胞凋亡因子，可抑制成纤维细胞凋亡；survivin可作用于各个凋亡途径的汇集点，抑制由caspase-3/caspase-7过度凋亡引起的细胞凋亡[3]。本研究主要分析病理性瘢痕成纤维组织细胞中相关凋亡因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3表达的阳性率，并与非病理性瘢痕和正常组织比较。

图1 Fas在病理性瘢痕中表达(SP染色，400×)

图2 Fas在正常组织中表达(SP染色，400×)

图3 caspase-3在病理性瘢痕中表达(SP染色，400×)

图4 caspase-3在非病理性瘢痕中表达(SP染色，400×)

图5 caspase-3在正常组织中表达(SP染色，400×)

图6 Bcl-2在病理性瘢痕中表达(SP染色，400×)

图7 Bcl-2在正常组织中表达(SP染色，400×)

图8 Survivin在病理性瘢痕中表达(SP染色，400×)

图9 Survivin在非病理性瘢痕中表达(SP染色，400×)

1 资料和方法

1.1 临床资料：标本均来源于2015年1月-2016年1月本院整形外科行瘢痕切除的患者，均经临床病理证实。病理性瘢痕46例，男21例，女25例；年龄8～48岁，平均(27.16±2.86)岁；其中瘢痕疙瘩20例，增生性瘢痕26例。非病理性瘢痕均为伤后伤口界限内生长，向外压迫周围组织，增殖后自行退化、挛缩而留下的纤维性组织，共选取25例，男12例，女13例；年龄7～53岁，平均(29.64±3.52)岁。正常皮肤组织为美容切除和全厚皮片移植剩余的全厚皮，共选取22例，男8例，女14例；年龄10～51岁，平均(29.41±3.94)岁。三组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。本次研究均取得患者的知情同意。

1.2 排除标准：①合并皮肤病、结缔组织病、传染病、重要脏器官疾病者；②既往有放化疗史、激光治疗史者；③1年内有局部注射药物、瘢痕处接受外用药物治疗者。

1.3 方法：所有标本离体后均用含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)固定，常规脱水、浸蜡、包埋，4～6μm厚切；常规脱蜡后置于蒸馏水新鲜配置的3％H2O2中，室温孵育15min，消除标本中内源性过氧化物酶活性，蒸馏清洗3次，2min/次，PBS浸泡2次，5min/次；抗原修复后，蒸馏水洗5次，1min/次，PBS冲洗2次，3min/次；滴加二抗同种动物血清封闭血液，室温下孵育10min；滴加一抗工作液，4℃恒温下过夜，0.01ml PBS冲洗3次，5min/次；分别滴加即用型生物素标记二抗、滴加辣根酶标记链霉卵蛋白工作液后孵育，0.01ml PBS冲洗3次，5min/次；滴加DAB显色剂，显微镜下观察显色情况，蒸馏水冲洗终止显色；苏木素复染，蒸馏水冲洗后，1％盐酸酒精分化，流水冲洗；二甲苯透明，中性树胶封固；PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定[4-5]：Fas主要定位于成纤维细胞膜，Bcl-2、survivin、caspase-3主要定位于成纤维细胞浆，镜下观察切片着色强度及面积进行评分。着色强度：0分，无着色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。阳性着色面积：0分，无着色；1分，着色面积＜1/3；2分，着色面积为1/3～2/3；3分，着色面积＞2/3。2项之和≥3分为阳性。1.5 统计学分析：采用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计数资料用率表示，采用χ2检验；相关性分析采用双变量Spearman检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组标本组织中Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3的表达：Fas在正常组织中的成纤维细胞膜内呈棕黄色，caspase-3在正常皮肤组织成纤维细胞浆内呈棕黄色，非病理性组织和病理性瘢痕组织中少量表达(见图1～5)；Bcl-2、survivin在病理性瘢痕组织成纤维细胞浆内呈棕黄色，非病理性瘢痕组织和正常皮肤组织中少量表达(见图6～10)。

2.2 三组标本组织中Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3的阳性表达率：病理性瘢痕成纤维组织中Fas、caspase-3阳性表达率分别为21.74％、23.91％低于非病理性瘢痕的60.0％、72.0％和正常皮肤组织的86.36％、90.90％，差异有统计学意义(P＜0.05)；Bcl-2、survivin阳性表达率分别为78.26％、82.61％高于非病理性瘢痕的44.0％、48.0％和正常皮肤组织的13.64％、18.18％，差异有统计学意义(P＜0.05)；且非病理性瘢痕和正常皮肤组织中上述指标也存在明显差异(P＜0.05)。见表1。

2.3 病理性瘢痕组织中Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3的相关性分析：Spearman相关分析结果显示，Fas蛋白与Bcl-2蛋白、survivin蛋白呈负相关关系(r=-0.513、-0.629，P＜0.05)，与caspase-3蛋白呈正相关关系(r=0.691，P＜0.05)；Bcl-2蛋白与survivin蛋白呈正相关关系(r=0.616，P＜0.05)，与caspase-3呈负相关关系(r=-0.638，P＜0.05)，survivin蛋白与caspase-3蛋白呈负相关关系(r=-0.621，P＜0.05)。

3 讨论

病理性瘢痕是发生于创伤、感染后的一种纤维代谢疾病，发病机制尚未完全明确。随着临床对病理性瘢痕组织相关生物细胞学和分子生物学研究的增多，发现细胞增生和凋亡失衡可能是病理性瘢痕的重要病理基础。王暑光等[6]指出，成纤维细胞凋亡不足可能在病理性瘢痕的发生中起重要作用。

Fas属于一种跨膜蛋白，在细胞凋亡过程中起信号传递作用，可表达于成纤维细胞，诱导细胞凋亡。研究发现，Fas与其受体结合后可最终形成死亡诱导信号，并激活Caspase的一系列凋亡蛋白，诱导细胞凋亡。目前，临床研究已证实，FasL-FasR系统可参与细胞增殖和调控[7]。杨爱琴等[8]发现尖锐湿疣患者病变皮损部位Fas呈低表达。

Bcl-2即B细胞淋巴细胞瘤/白血病-2基因，首次由Tsujimoto在t(14,18)染色体异位的滤泡性淋巴瘤中发现，该基因表达可抑制多种组织细胞凋亡，是重要的抗细胞凋亡因子。随着临床对Bcl-2抗凋亡机制的深入研究，发现其可能通过抑制脂质过氧化反应、钙离子跨膜流动及caspase活化等发挥抗凋亡作用。陈钊等[9]指出，瘢痕疙瘩成纤维组织中Bcl-2阳性表达升高。

survivin迄今为止是凋亡抑制蛋白家族中的一员，在胚胎或胎儿组织、器官中呈高表达，但成人分化成熟的终末组织无表达。survivin作为一种抗细胞凋亡因子，主要通过与caspase家族相互作用抑制细胞凋亡，其机制可能为：针对caspase-8经细胞死亡刺激因子(如：Fas等)启动的外源性细胞凋亡，survivin可直接或间接影响caspase-3/caspase-7活性，阻断其水解微管结构蛋白；针对caspase-9启动的内源性细胞凋亡，可通过阻断细胞凋亡信号的传导，间接抑制caspase-3/caspase-7活性[10]。

caspase家族在细胞凋亡中起关键作用，其表达异常增多会诱导细胞凋亡。caspase-3是caspase家族中最重要的成员之一，是介导细胞凋亡的重要效应因子之一。吴焱秋[11]指出，caspase-3可介导多数细胞凋亡因子引起的细胞凋亡。临床研究发现，caspase-3激活的途径主要通过凋亡刺激因子(Fas、TNFR等)与受体结合，诱导上游的caspase-8被激活，或线粒体释放细胞色素C诱导的下游caspase-9被激活，进而导致下游的caspase-3被激活，参与细胞凋亡。万远芳等[12]报道，皮肤红斑狼疮患者皮损组织中caspase-3的活性明显高于正常皮肤组织，可能参与皮肤红斑狼疮发病。

本研究中，病理性瘢痕成纤维组织中Fas、caspase-3阳性表达率低于非病理性瘢痕和正常皮肤组织，Bcl-2、survivin阳性表达率明显高于非病理性瘢痕和正常皮肤组织(P＜0.05)；且非病理性瘢痕和正常皮肤组织中上述指标也存在明显差异(P＜0.05)，说明成纤维细胞抗凋亡因子Bcl-2、survivin高表达，Fas、caspase-3低表达可能参与病理性瘢痕形成过程。付昱等[13]研究指出，黄芪总苷可通过抑制survivin、 Bcl-2，避免成纤维细胞过度增殖，从而起到治疗瘢痕疙瘩的效果，认为凋亡相关因子survivin、Bcl-2过度表达可能参与病理性瘢痕形成。张苏文等[14]进行体外研究发现，肿瘤坏死因子α刺激基因(TSG-6)可通过促进凋亡相关因子caspase-3高表达达到诱导成纤维细胞凋亡的目的。另外，Spearman相关分析显示，Fas蛋白与Bcl-2蛋白、survivin蛋白呈负相关关系(P＜0.05)，与caspase-3蛋白呈正相关(P＜0.05)；Bcl-2蛋白与survivin蛋白呈正相关，与caspase-3蛋白呈负相关(P＜0.05)；survivin蛋白与caspase-3蛋白呈负相关关系(P＜0.05)，说明病理性瘢痕组织凋亡因子异常表达可能存在相互作用的关系，但具体作用机制尚有待研究。

综上，病理性瘢痕成纤维组织中，Bcl-2、survivin表

表1 三组标本组织中Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3阳性表达率 [例(％)]

(本文未完，)达呈高阳性率，Fas、caspase-3表达呈低阳性率，且凋亡因子Bcl-2、survivin、Fas、caspase-3异常表达存在相关性，可能是病理性瘢痕重要的发病机制。有待深入研究凋亡相关因子的作用机制，进一步探讨病理性瘢痕的发病机制，为临床防治病理性瘢痕提供新思路。

[1]李周娜,陈香儒,金哲虎.4-羟苯基维胺在不同载体中对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及凋亡影响[J].中华皮肤科杂志,2017,50(3):195-198.

[2]张金丽,曹雯娟,熊喜峰,等.穗花杉双黄酮调控人瘢痕成纤维细胞活性及凋亡的研究[J].中国美容整形外科杂志,2016,27(3):173-176.

[3]Sam S,Sam MR,Esmaeillou M,et al.Effective Targeting Survivin,Caspase-3 and MicroRNA-16-1 Expression by Methyl-3-pentyl-6-methoxyprodigiosene Triggers Apoptosis in Colorectal Cancer Stem-Like Cells[J].Pathol Oncol Res,2016,22(4):715-716.

[4]Hyun HB,Lee WS,Go SI,et al.The fl avonoid morin from Moraceae induces apoptosis by modulation of Bcl-2 family members and Fas receptor in HCT 116 cells[J].Int J Oncol,2015,46(6):2670-2678.

[5]Lebelt A,Rutkowski R,Och W,et al.Survivin,caspase-3 and MIB-1 expression in astrocytic tumors of various grades[J].Adv Med Sci,2016,61(2):237-243.

[6]王暑光,王静成,孙钰,等.丝裂霉素C调控miR-200b启动子甲基化诱导成纤维细胞凋亡[J].实用医学杂志,2017,33(6):876-879.

[7]蔡泽明,赵莹,张斌,等.早期斑秃皮损处炎症细胞因子及凋亡因子的异常表达[J].中华皮肤科杂志,2015,48(2):128-131.

[8]杨爱琴,卞坤鹏,翟伟,等.尖锐湿疣患者疣体病变皮损组织中Fas、FasL及Foxp3表达与HPV DNA载量的相关性研究[J].中华医院感染学杂志,2017,27(6):1366-1369.

[9]陈钊,李小静,王晖.构建肿瘤坏死因子α刺激基因6慢病毒表达及干扰载体及对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的影响[J].中国组织工程研究,2016,20(29):4319-4327.

[10]马莎,林俊,晋松,等.shRNA抑制survivin基因表达对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响[J].重庆医学,2015,44(35):4922-4924.

[11]吴焱秋,柴家科,张海龙,等.烧伤后大鼠不同骨骼肌凋亡相关蛋白的转录表达变化[J].中国美容医学,2014,23(8):633-636.

[12]万远芳,陶春蓉,龚娟,等.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在皮肤红斑狼疮患者外周血单个核细胞、皮损组织与血清中表达的研究[J].临床皮肤科杂志,2017,46(3):174-178.

[13]付昱,张良,陈娜,等.黄芪总苷液对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖凋亡的影响[J].重庆医学,2017,46(6):746-748.

[14]张苏文,李小静,陈钊,等.TSG-6对人病理性瘢痕成纤维细胞增殖与凋亡的影响[J].安徽医科大学学报,2016,51(1):102-105.

The Expression and Signi fi cance of Apoptotic Factors Fas,Bcl-2,Survivin and Caspase-3 Protein in Pathological Scar Fibroblasts

LIU Qi-sheng
(Department of Clinical Laboratory,Daye Hospital of Traditional Chinese Medicine,Daye 435100,Hubei,China)

Objective To investigate the expression and significance of apoptotic factors Fas,Bcl-2,survivin and caspase-3 protein in pathological scar fi broblasts.Methods The positive expression rates of apoptosis-associated factors Fas,Bcl-2,survivin and Caspase-3 protein in 46 cases of pathological scar tissues,25 cases of non-pathological scar tissues and 22 cases of normal skin tissues were detected by Western bolt,and the correlation was analyzed.Results The positive expression rates of Fas and caspase-3 in pathological scar fi broblasts (21.74％,23.91％) were lower than those in the non-pathological scar (60.0％,72.0％) or those in normal skin tissues (86.36％,90.90％) (P＜0.05),while the positive expression rates of Bcl-2 and survivin in pathological scar fi broblasts (78.26％,82.61％) were signi fi cantly higher than those in non-pathological scars (44.0％,48.0％)or those in normal skin tissues (13.64％,18.18％) (P＜0.05). There were signi fi cant differences in above-mentioned indexes between non-pathological scars and normal skin tissues (P＜0.05). Spearman correlation analysis showed that Fsa protein was negatively related to Bcl-2 protein and survivin protein (r=-0.513,-0.629,P＜0.05),and positively correlated with caspase-3 protein (r=0.691,P＜0.05). Bcl-2 protein was positively correlated survivin protein (r=0.6.16,P＜0.05),and negatively correlated with caspase-3 protein (r=-0.638,P＜0.05). The survivin protein was negatively correlated with caspase-3 protein(r=-0.621,P＜0.05).Conclusion The abnormal expression of apoptosis related factors Fas,Bcl-2,survivin and caspase-3 in pathological scar fi broblasts may be involved in the occurrence of pathological scar.

pathological scar; fi broblast; apoptosis associated factor; expression

R619+.6

A

1008-6455(2017)11-0063-03

2017-08-14

2017-09-08

编辑/朱婉蓉