慢性脑缺血对大鼠海马钙通道Cav1.3表达的影响

郭　　森，朱　　江

（1.承德医学院，河北承德　067000；2.承德医学院附属医院）

慢性脑缺血对大鼠海马钙通道Cav1.3表达的影响

郭森1，朱江2

（1.承德医学院，河北承德067000；2.承德医学院附属医院）

目的:探讨慢性脑缺血后大鼠海马钙通道Cav1.3蛋白表达的变化。方法：雄性Wistar大鼠36只随机分为假手术组、缺血7d组和缺血14d组。通过阻断左侧椎动脉和双侧颈总动脉的方法制作慢性脑缺血模型。采用尼氏染色法观察海马CA1区神经元形态结构的变化，蛋白质印迹法检测大鼠海马钙通道Cav1.3蛋白的表达情况。结果：与缺血7d组比较，缺血14d组大鼠海马CA1区神经元的病理变化明显加重。随着缺血时间的延长，海马钙通道Cav1.3蛋白的表达明显降低。结论：慢性脑缺血可能通过降低海马钙通道Cav1.3蛋白的表达影响海马神经元的正常功能。

慢性脑缺血；海马；L型钙通道

L型钙通道是身体内重要的电压依赖型钙通道，根据其α1亚单位编码基因的不同，可进一步分为Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4四个亚型。Cav1.3钙通道主要分布于中枢神经系统，参与钙稳态、激素分泌、基因表达和突触可塑性等多种功能的调控，并在神经元的存活和死亡中有重要作用[1]。近年来，有学者通过对Cav1.3钙通道在正常中枢神经系统中分布特征的研究深入探讨了Cav1.3钙通道的具体功能及作用机制[2]。本研究对脑海马组织缺血过程中神经元钙通道Cav1.3表达的变化进行了探讨，以分析钙通道Cav1.3在脑组织缺血过程中发挥的作用及可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组SPF级成年雄性Wistar大鼠36只，200-220g，随机分为3组，假手术组、缺血7d组和缺血14d组。缺血组大鼠阻断左侧椎动脉和双侧颈总动脉；假手术组只暴露相应动脉，不予阻断。

1.2主要药品和试剂兔源性抗Cav1.3抗体（Abcam公司），小鼠源性抗β-actin抗体、总蛋白提取试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3大鼠脑缺血模型的制备采用改良的的三血管闭塞法[3]制作大鼠慢性脑缺血模型。10%水合氯醛腹腔注射麻醉（350mg/kg）大鼠，仰位固定，暴露右侧颈总动脉并结扎切断；然后俯位固定，沿颈部后正中线切开皮肤，暴露第1颈椎横突孔，电凝左侧椎动脉。1周后结扎左侧颈总动脉。

1.4取材缺血7d组和缺血14d组大鼠分别于左侧颈总动脉结扎后第7d和第14d取材，每组6只大鼠用于光镜标本取材，6只用于蛋白印记取材。

1.4.1光镜标本：10%水合氯醛麻醉大鼠，开胸经主动脉插管后4%多聚甲醛灌流固定，取出脑组织后30%蔗糖浸至组织下沉，行冠状切面冷冻切片（厚50μm）。

1.4.2Western Blot标本：10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速断头取脑，分离海马、称重，组织匀浆，提取蛋白，BCA法蛋白定量。

1.5检测方法

1.5.1尼氏染色：冰冻切片用0.5%明胶贴片，自然干燥，常规尼氏染色（0.25%硫堇染液）。

1.5.2Western Blot法：采用Western Blot法检测海马组织Cav1.3蛋白的表达情况。6% SDS-PAGE凝胶电泳（120V，2.5h），蛋白上样量100μg，转膜（300mA，2h），5% BSA封闭2h，Cav1.3一抗（1∶500）4℃孵育过夜，HRP标记山羊抗兔IgG抗体（1∶2000）室温孵育1h，ECL发光液显影。采用Image-Pro Plus 6.0软件对显影条带进行分析，以目的条带和β-actin条带的IOD比值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.6统计分析采用SPSS 19.0软件进行统计分析，各组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1海马神经元尼氏染色结果假手术组大鼠海马CA1区神经元分布密集、轮廓清晰，尼氏体着色明显，多数细胞可见核仁（图1A）。缺血7d组大鼠海马CA1区神经元分布较密集，神经元胞体较假手术组大，染色较浅（图1B）。缺血14d组大鼠海马CA1区神经元分布比较稀疏，胞体轮廓模糊、染色浅（图1C）。

2.2Western Blot法检测结果假手术组大鼠海马Cav1.3蛋白的表达明显高于缺血7d组和缺血14d组大鼠（P＜0.05）；缺血7d组大鼠海马Cav1.3蛋白的表达明显高于缺血14d组大鼠（P＜0.05，见图2、附表）。

图1　海马CA1区尼氏染色结果

图2　各组大鼠海马钙通道Cav1.3蛋白的表达（Western Blot法）

附表　各组大鼠海马钙通道Cav1.3蛋白的表达（n = 6，±s）

附表　各组大鼠海马钙通道Cav1.3蛋白的表达（n = 6，±s）

与假手术组比较：*P＜0.05；与缺血7d组比较：△P＜0.05

组别　　钙通道Cav1.3蛋白（IOD比值）假手术组　1.52±0.14缺血7d组　1.05±0.09＊缺血14d组　0.85±0.05＊△

3　讨论

在神经元缺血性损伤的过程中，细胞内Ca2+超载是公认的启动细胞损伤的关键因素。L-型电压依赖性钙通道Cav1.3在中枢神经系统有着较为广泛的分布和重要的生理功能，其在神经系统缺血性损伤Ca2+超载过程中的作用一直广受关注[4-5]。以往有研究显示，缺血24h内大鼠大脑皮质中的L-型钙通道开放明显增加，提示L-型钙通道可能是Ca2+内流的主要通道[6]。但是，在慢性缺血性损伤的过程中L-型钙通道的变化情况目前报道较少。

本研究中尼氏染色结果显示，随着缺血时间的延长神经元损伤的程度逐渐加重，但大鼠海马中L-型钙通道Cav1.3蛋白的表达（Western Blot法）并未随缺血损伤的加重而增加，而是表达逐渐降低。考虑出现这一现象的可能原因是：①Ca2+超载在急性缺血性损伤所致的神经元死亡中起关键作用，而慢性缺血性损伤神经元以凋亡为主，Ca2+超载现象不明显，因此钙通道Cav1.3表达不增加。②在慢性缺血性损伤中正常生理功能的紊乱可能是造成神经元损伤更重要的机制。钙通道Cav1.3在正常神经元中参与多种重要的生理功能，其表达的减少更符合慢性缺血时神经元的损伤机制[7-8]。并且已有报道指出，大脑皮质神经元长期接触L-型钙通道拮抗剂，使胞内Ca2+降低可诱导神经元凋亡，尤其是在缺血所致迟发性神经元死亡的过程中， 阻断L型电压依赖性钙通道可致神经细胞凋亡[9]，而L-型钙通道激动剂Bay K8644可以阻断缺糖缺氧诱导的细胞凋亡[10]。由此推测，在慢性缺血的过程中，钙通道Cav1.3表达减少本身可能也是导致迟发性神经元死亡的重要原因。

[1]Li XM,Li JG,Hu Q,et al.Changes in single L-type calcium channel currents in CA1 pyramidal neurons of rat hippocampus after transient forebrain ischemia[J].Prog Biochem Biophys,2003, 30(5):755-759.

[2]Sukiasyan N,Hultborn H,Zhang ML,et al.Distribution of calcium channel Cav1.3 immunoreactivity in the rat spinal cord and brain stem[J].Neuroscience,2009,159(1):217-235.

[3]刘晖章，军建，张磊.改良型三血管结扎慢性脑缺血模型大鼠的行为学评价[J].中华行为医学与脑科学杂志，2009，11 (18)：966-969.

[4]Liu Y,Harding M,Pittman,et al.Cav1.2 and Cav1.3 L-type calcium channels regulate dopaminergic f iring activity in the mouse ventral tegmental area[J].J Neurophysiol,2014,112(5): 1119-1130.

[5]Berger SM,Bartsch D.The role of L-type voltage-gated calcium channels Cav1.2 and Cav1.3 in normal and pathological brain function[J].Cell Tissue Res,2014,357(2):463-476.

[6]王金华，刘佩芳.丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元L-型钙通道表达的影响[J].中国中医药科技，2008，1（56）：442.

[7]Hirtz JJ, Boesen M, Braun N, et al. Cav1.3 calcium channels are required for normal development of the auditory brainstem[J].J Neurosci,2011,31(22):8280-8294.

[8]Nunez-Santana FL, Oh Matthew M, Antion MD, et al. Surface L-type Ca2+channel expression levels are increased in aged hippocampus [J].Aging Cell,2014,13(1):111-120.

[9]Hank S, Kang HJ, Kim EY, et al. 1,2-Bis(2-aminophenoxy) ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid induce caspase mediated apoptosis andreactive oxygen species-mediated necrosis in cultured cortical neurons[J].J Neurochem,2001,78(2):230-239.

[10]Wang C,Nguyen HN,Maguire JL,et al.Role of intracellular calcium store in cell death from oxygen-glucose deprivation in a neuronal cell line[J].J Cereb Blood Flow Metab,2002,22(2): 206-214.

(基础医学栏目编辑：陈志宏)

EFFECTS OF CHRONIC CEREBRAL ISCHEMIA ON CALCIUM CHANNEL CAV1.3 EXPRESSION IN HIPPOCAMPUS OF RATS

GUO Sen, ZHU Jiang
(Chengde Medical College, Hebei Cheng 067000, China)

Objective: To investigate the changes of calcium channel Cav1.3 protein expression in hippocampus of chronic cerebral ischemia rats. Methods:36 male Wistar rats were randomly divided into sham-operation group, ischemia 7 days group andischemia 14 days group. The chronic cerebral ischemia rats’ model was established by blocking left vertebral artery and common carotid artery on both sides. Nissl’s staining was used to observe the morphology of neurons in hippocampus CA1 region,Western Blot to detect calcium channel Cav1.3 protein expression in hippocampus. Results:Compared with 7 days group, the pathological changes of neurons in hippocampus CA1 region of rats in 14 days group markedly aggravated. With prolongation of ischemic time, the calcium channel Cav1.3 protein expression obviously decreased. Conclusions:Chronic cerebral ischemia may affect the normal function of hippocampal neurons by decreasing the expression of calcium channel Cav1.3 protein in hippocampus.

Chronic cerebral ischemia; Hippocampus; L-type calcium channel

R322.81

A

1004-6879（2017）01-0005-04

（2016-08-01）