枳壳精准煮散饮片质量的均一性

黄 娟 张 靖 宫 璐 李西文 张 鹏 徐 文 丘小惠 黄志海

(1 广州中医药大学第二附属医院，广东省中医药科学院中国中医科学院广东分院，广州,510006; 2 中国中医科学院中药研究所，北京，100700)

枳壳精准煮散饮片质量的均一性

黄 娟1张 靖1宫 璐1李西文2张 鹏2徐 文1丘小惠1黄志海1

(1 广州中医药大学第二附属医院，广东省中医药科学院中国中医科学院广东分院，广州,510006; 2 中国中医科学院中药研究所，北京，100700)

目的：探讨精准煮散饮片与市售原饮片成分溶出及质量均一性差异。方法：应用ITS2序列作为DNA条形码对枳壳饮片进行鉴定；比较枳壳市售原饮片及精准煮散饮片的干膏收率；采用HPLC-DAD法进行3批次饮片混合粉碎前后质量均一性、指纹图谱及相似度评价。结果：枳壳煮散饮片出膏率略高于市售饮片出膏率；精准煮散饮片提取液中柚皮苷溶出较市售饮片高，市售饮片柚皮苷、新橙皮苷批间溶出量有明显的差异性RSD分别为9.71%及24.71%，混合制成煮散饮片后差异缩小RSD分别为4.73%、4.94%。指纹图谱相似度评价结果显示，制成煮散饮片后相似度提高，且共有峰峰面积均有提高。结论：枳壳市售饮片制成精准煮散饮片基本属性没有变化，但精准煮散饮片能提饮片的煎煮效率及均一性，发展精准煮散饮片具有良好的应用前景。

枳壳；精准煮散饮片；DNA条形码；指纹图谱

枳壳为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实，具有理气宽中，行滞消胀等功效，可用于胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停，脏器下垂[1]。既往医学研究表明，枳壳有促胃肠动力、抗消化不良、抗氧化、抗菌、消炎、抗抑郁和抗肿瘤作用[2-5]。黄酮、生物碱、挥发油是其主要药理活性成分，目前研究普遍以柚皮苷、新橙皮苷的含量来评价枳壳的质量[6-7]。

宋代以前所用枳壳的原植物为芸香科枸橘PoncirustrifoliataRaf.，直至明代原植物主要来源衍变为酸橙及其变种，目前尚有福建、广东等地区至今仍以柑橘属CitrusL.多种植物作为枳壳药用来源。我国各地区的枳壳类药材的基原、分布各不相同,江西清江产的“江枳壳”为枳壳的道地药材，其原植物为酸橙的变种臭橙C.aurantium‘Xiucheng’，少部分为香橙C.aurantium‘Xiangcheng’。主流品种“川枳壳”其原植物为酸橙，产量较大的“湘枳壳”原植物是以枸橘为砧木，酸橙为接穗的嫁接品种，称为枳橙C.aurantium×P.trifoliata[8]。

由于酸橙的栽培变种品种繁多，且有枸橘属来源的品种，造成枳壳商品来源复杂混乱，特别是切制成薄片片后大多有混杂。产地与生长的差异化、货源的不稳定性、中药饮片的形态差异等因素，导致枳壳饮片批间、批内质量不均一，直接影响临床用药疗效的稳定。因此需要一种易于鉴定和检测，可经标准化工艺制备、规模化生产、质量均一，以提高临床用药精准性的新型饮片。因此，根据我们前期提出的“精准煮散饮片”的概念与思路方法，将对枳壳煮散饮片进行研究。鉴于中药材化学成分体系的复杂性，我们采用化学指纹图谱表征药材化学组成结合DNA分子鉴定技术，以饮片规格、含量均匀度、指纹图谱与相似度评价、DNA序列比对为考查重点，对煮散体系的合理性及优越性进行综合评价研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国Agilent 1260型高效液相色谱仪(四元泵，自动进样器及DAD检测器)，BT 125 D十万分之一分析天平、BS 224 S万分之一分析天平、HTP-312电子天平、DK-S26电热水浴锅、Centrifuge 5430R高速台式冷冻离心机、台湾荣聪铁工厂粉碎机。

1.2 试剂 乙腈、甲酸均为色谱纯，购自美国Fisher公司；煎煮用水为蒸馏水、液相用水为millipore制备纯水。

1.3 分析样品 柚皮苷(含量≥98%，批号B20182)，购于上海源叶生物科技有限公司；新橙皮苷(含量99.6%，批号111857-201102)，购于中国食品药品检定研究院。枳壳市售饮片分别购自康美药业有限公司(产地江西,S1、S2批号160301561，160901351)及岭南中药饮片有限公司(产地四川，S3批号1609001)，经本实验室黄志海中药师鉴定均为现行版《中华人民共和国药典》(一部)收载品种。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 含量测定采用高效液相方法测定，色谱柱为Kinetex C18柱(2.6 μm，100 mm×4.6 mm)。检测方法按照中华人民共和国药典2015年版一部枳壳项下含量测定方法测定市售饮片及煮散饮片提取液中柚皮苷、新橙皮苷的含量。

指纹图谱色谱条件为：色谱柱同上；流动相为乙腈(B)—0.1%甲酸水(A)，梯度洗脱(5%→75%)；流速：1 mL/min，检测波长：283 nm；柱温：25 ℃；洗脱时间：30 min；进样体积：5 μL。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取柚皮苷、新橙皮苷对照品适量，加甲醇配制成含柚皮苷0.51 mg/mL、新橙皮苷0.50 mg/mL的对照品溶液，置冰箱中4 ℃保存，备用。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 饮片制备 不同规格枳壳煮散饮片制备：取枳壳市售饮片(S1)，粉碎，混匀，过筛，分别得到5-10目(2～4 mm)、10-24目(0.8～2 mm)、24-65目(0.25～0.8 mm)等不同粒径范围的煮散饮片。

质量均一性实验枳壳精准煮散饮片制备：分别取3个批次市售饮片(S1～S3)各200 g，充分混合后，粉碎，混匀，过筛，得10～65目粒径范围的煮散饮片。原饮片及煮散饮片形态(图1)。

图1 枳壳药材、原饮片及煮散饮片形态

2.3.2 供试品溶液的制备 取不同批次原饮片各取20 g(S1～S3)；另取枳壳精准煮散饮片300 g，均匀摊平，画格分为10份，随机选取3份，从每份中分别称取20 g(S4-S6)，按2.2项下相同方法煎煮。合并煎煮液，浓缩成100 mL溶液，即浓缩为0.2 g/mL的原药材溶液。取该浓缩液2.5 mL至10 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，即得供试品溶液，进样前用0.22 μm滤膜过滤。

2.4 DNA条形码检测 选取样本各约40 mg，用组织研磨仪磨碎，采用植物DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.,China)提取基因组总DNA。ITS2序列扩增采用正向引物ITS2F:5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物：ITS3R:5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′，进行扩增。PCR反应体系为25 μL，包括2×Taq PCR Mix酶(北京艾德莱生物科技有限公司)12.5 μL，正向、反向引物各1 μL(2.5 μmol/L)，模板DNA 2.0 μL(30～100 ng)，加ddH2O补足至25 μL。扩增程序：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(40个循环)；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物采用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将电泳条带清晰、明亮、单一的PCR产物送测序公司进行双向测序。序列拼接采用CodonCode Alinger 6.02软件，利用软件MEGA 6.06分析比对，分析ITS2序列特点。

2.5 出膏率的检测 称取原饮片及不同粒径范围煮散饮片各100 g，采用标准汤剂煎煮法进行提取。分别加8倍量水，先浸泡30 min，煮沸30 min，过滤分离出煎煮液，再加6倍量水煎煮30 min。合并煎煮液，浓缩成100 mL溶液，即浓缩为1 g/mL的药材溶液。精密量取25 mL，蒸干，得干浸膏重量，计算出膏率。精密吸取混合均匀的不同规格的饮片供试品溶液25 mL于蒸发皿中，60 ℃真空干燥至恒重，称量，根据出膏率公式[9]计算出膏率。

2.5 样品测定结果

2.5.1 原饮片与不同规格煮散饮片出膏率比较 结果表明，与原饮片比较，粉碎后不同粒径煮散饮片的出膏率均有增加；但不同粒径之间样品的出膏率差异不明显。见表1。

表1 枳壳市售原饮片与精准煮散饮片出膏率

2.5.2 含量均一性评价 取对照品溶液及样品溶液，按2.1项下色谱条件进行分析，对照品及样品中柚皮苷、新橙皮苷的色谱峰分离效果佳，杂峰较少，峰形良好，适合枳壳饮片中柚皮苷、新橙皮苷含量测定分析，对照品溶液及样品溶液HPLC-DAD色谱图分别见图2、图3。

图 2对照品HPLC-DAD色谱图

注：1：柚皮苷；2：新橙皮苷

图3 枳壳饮片HPLC-DAD色谱图

注：1：柚皮苷；2：新橙皮苷

含量测定结果表明(表2)，各批次枳壳原饮片药材中柚皮苷、新橙皮苷2种成分的提取率差异均较大，波动范围分别在14.34～17.20 mg/g及5.89～9.46 mg/g，RSD值分别为9.71%及24.70%。3批原饮片经混合均匀并制成煮散饮片后，其柚皮苷溶出量增加，且二者RSD值显著下降，均低于5%。

3.5.3 指纹图谱研究 按2.3项下方法制成供试品溶液，按2.1项下方法进行测定，枳壳市售原饮片及精准煮散饮片色谱峰指纹图谱见图4，采用国家药典委员会2014年版指纹图谱相似度评价软件计算市售原饮片混合前后指纹图谱相似度。见表3。结果显示，在现有的检测方法下，枳壳市售饮片与经粉碎混匀的煮散饮片共6批样品的主要色谱峰均可以良好的匹配，指纹图谱相似度基本一致，在共有峰的种类上未有明显改变，经粉碎混匀后的精准煮散饮片指纹图谱显示高度的相似性，粉碎后样品(S4-S6)的相似度均在0.999以上。

图4 枳壳市售原饮片及精准煮散饮片HPLC指纹图谱

以枳壳原饮片中新橙皮苷的平均峰面积为基准，计算制得精准煮散饮片前后各共有峰的相对峰面积。结果表明，不同批次药材经混合制成精准煮散饮片后，部分共有峰溶出率有不同程度的升高。其中峰6为柚皮苷，峰8为新橙皮苷。

3.5.4 ITS2序列分析 应用MEGA6.06分析枳壳3条ITS2序列特征，序列比对后长度为232 bp，种内存在2个变异位点，为183处G/A变异，188处G/T

表2 原饮片与精准煮散饮片提取液中柚皮苷、新橙皮苷含量

变异。A、C、G、T的碱基含量分别为15.25%、38.42%、32.37%、13.96%，GC含量达70.79%。3条psbA-trnH序列比对后长度为422 bp，种内无变异位点。2种序列经BLAST搜索结果显示相似性最高的为酸橙Citrusaurantium或甜橙Citrussinensis。主导单倍型序列特征见图5、6。

表3 饮片指纹图谱相似度

表4 共有峰相对峰面积比较

图5 枳壳ITS2序列

图6 枳壳psbA-trnH序列

3 讨论

枳壳的ITS2和psbA-trnH条形码在NCBI数据库和中药材DNA条形码鉴定系统中进行BLAST搜索时，能比对到甜橙Citrussinensis、酸橙Citrusaurantium及同属物种。由于该属植物易发生芽变、种属间易杂交、体细胞突变率高、人工栽培品种繁多、研究者采用的分类标准的不同等特点，导致该属在种的划分上存在较大分歧[10]。罗焜等[11]对包括橘属7个品种在内的芸香科72属300个样本进行DNA条形码筛选比较研究时发现，ITS2和psbA-trnH序列在属水平上的鉴定成功率为100%，但目前暂未发现可用于柑橘属种间鉴定的DNA条形码序列[12-14]。因此，对于枳壳的物种鉴定，在DNA条形码鉴定到属的基础上，应辅以其他手段如指纹图谱技术进一步明确种属。

精准煮散饮片经过对饮片形制的改进，使饮片体积变小，颗粒均匀，使饮片分装、调剂的自动化设备得以应用，可改变以往粗放、低效的生产应用模式，实现用药各环节的规范化标准化，提高临床用药的准确性。同时，发展精准煮散饮片能提高中药药效物质的溶出和保证汤剂煎煮质量的稳定，从而在保证疗效的前提下，可降低药物使用量，节约资源，提高中药资源的合理利用，降低药品费用。

本研究探讨了DNA条形码鉴定技术、中药指纹图谱技术结合用于煮散饮片的质量控制，结果表明现有技术可以满足煮散饮片的定性定量检测要求，有效实现煮散饮片的精准化鉴定和检测，为解决传统煮散的“辨药之难”提供了新的思路。

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ComparativeStudyonQualityUniformityofPrecisePowderDecoctionPiecesofAurantiiFructus

Huang Juan1,Zhang Jing1,Gong Lu1,Li Xiwen2,Zhang Peng2,Xu Wen1,Qiu Xiaohui1,Huang Zhihai1

(1SecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,GuangdongProvincialAcademyofChineseMedicalSciences,ChinaAcademyofChineseMedicalSciencesGuangdongBranch,Guangzhou510006,China; 2InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

Objective:This study aimed to evaluate the composition dissolution and quality uniformity of precise powder decoction pieces (PPDP) of Aurantii Fructus (AF),compared with the traditional commercial slices.Chemical fingerprint methods and DNA molecular identification technology based on internal transcribed spacer 2 (ITS2) were applied.MethodsDifferent specifications of PPDP were prepared,their dry extract contents were compared with those of commercial slices.Three batches of commercial slices were collected,and the content uniformity,fingerprint and similarity evaluation before and after the mixing and pulverization were analyzed by HPLC-DAD and DNA sequence alignment.ResultsPaste rate of PPDP were slightly higher than that of the traditional commercial slices.The dissolution of naringin of PPDP was higher than that of traditional commercial slices.RSDof inter-assay dissolutions of naringin and neohesperidin of commercial slices were 9.71% and 24.71% respectively,which could be reduced to 4.73% and 4.94% after mixing and preparing into PPDP.Finger print image shows there were high similarity between decoction and slices.ConclusionPPDP and traditional commercial slices of AF shared consistent properties.PPDP apparently improved the extraction rate,the dissolution rate and quality uniformity,and it is recommended to be used in clinical practice.

Aurantii Fructus; Precise powder decoction pieces; DNA; Fingerprint

广东省中医院院内专项(2015KT1817)；中国中医科学院中医药健康服务发展专项(ZZ0908067)；国家自然基金(81402887)

黄娟(1987.10—)，女，博士在读研究生，助理研究员，研究方向：中药质量控制与中药体内代谢

丘小惠(1969.06—)，女，硕士研究生，研究员，团队负责人，研究方向：中药质量与中药炮制研究，Tel：(020)39318571，E-mail：gxhqxh@medmail.com.cn，jxu@icmm.ac.cn；黄志海(1974.08—)，男，硕士研究生，主任药师，团队负责人，研究方向：中药资源与中药炮制，Tel：(020)39318571，E-mail：1925196926@qq.com

R91；R289.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.057

(2017-01-03收稿 责任编辑：杨觉雄)