过氧化氢对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)生长及生理特性的影响

0 前言

近年来水体富营养化现象日益严重，人们对于水华的关注和研究甚多。现有文献中关于水华的定义较为详细的说法有：藻类是水体生态系统的正常组成部分，但其过度生长可能带来问题。藻类水华主要是由营养过剩引起的，特别是磷和氮[1]。水华发生是多种因素共同作用的结果，这些因素包括：①水体中丰富的N、P营养物质，BOD及其他微量元素；②适宜的温度和光照；③适宜的水文地理条件,如缓慢的水流等。由于湖泊、水库水体生态系统相对容易满足上述条件(特别是水流条件)，因此湖、库水体发生“水华”现象远多于河流[2]。在淡水中可能产生水华的藻类有蓝藻门的微囊藻属、鱼腥藻属、束丝藻属、胶刺藻属等，除此之外，还有绿藻门和硅藻门的一些种类[3]。如滇池、太湖蓝藻水华爆发导致生活用水污染，类似情况多有发生。因此，必须高度重视蓝藻水华，深入了解其危害并彻底清除蓝藻水华。蓝藻水华导致的危害主要有：①水体中溶氧降低；②抑制其他藻类生长；③影响鱼类生长从而影响水体养殖；④产生蓝藻毒素影响水质；⑤水体生态系统失衡；⑥影响供水；⑦影响旅游业[4]。

蓝藻水华防治措施包括化学法、物理法、生物法、水力学法和联用法[5]。最常用的是化学药剂法，其原理是金属离子抑制藻类的正常代谢，还可通过絮凝作用沉降蓝藻。采用化学试剂虽然能快速杀灭蓝藻，但也有其弊端，如容易破坏水体功能，而且会对蓝藻之外的有益藻产生影响，最重要的是不能彻底根除蓝藻水华。物理方法如调水稀释、曝气、蓝藻打捞、粘土絮凝等可以有效减少氮磷含量，改善水体，从而治理蓝藻水华，但物理方法对于大水面实施困难，而且耗费大量的人力、物力、财力，有些方法还可能会造成二次污染。水体中释放的藻毒素也可通过活性炭吸附法去除。生物法包括使用溶藻微生物、高等植物、及放养滤食性鱼类鲢、鳙等可以有效治理蓝藻水华。

过氧化氢，其水溶液成为双氧水，氧化性强，安全易得，且其分解产物为水和氧气，不会产生新的污染物，是一种重要的绿色化学试剂[6]。过氧化氢还是一种活性氧(ROS)物质，不仅会影响植物的光合作用，还会使某些基因表达发生紊乱，并且会使生物体细胞发生膜脂过氧化作用，对细胞产生损伤，从而影响生物体的正常生长和繁殖，因此，过氧化氢能够有效杀死藻细胞，是一种潜在的除藻剂。铜绿微囊藻属于蓝藻门、色球藻科、色球藻目、微囊藻属，广泛分布于有机质丰富的湖泊、池塘等水体中，是富营养化水体中形成蓝藻水华的一种优势藻类[7]。本研究以铜绿微囊藻为实验材料，研究不同浓度的过氧化氢处理对藻细胞数量和生理生化指标的影响，以探讨过氧化氢对藻细胞的生长抑制及氧化损伤效应，为过氧化氢除藻机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料和藻种培养

实验所用铜绿微囊藻FACHB-905藻种取自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库(FACHB collection)。本实验以藻类常用BG-11 液体培养基为培养介质来培养藻种，藻种接于150mL锥形瓶中(内含100mLBG-11液体培养基)并置于光照培养箱中培养，温度设为25℃，光暗周期12h:12h，光照强度为30～50u mol.m-2.s-1，培养期间每天定时摇动锥形瓶3～4次。

1.2 实验方法

1.2.1 绘制标准曲线

取处于对数生长期的铜绿微囊藻，接种5mL藻液至100mLBG-11液体培养基中，置于光照培养箱中进行培养，培养条件同藻种培养条件，连续培养18d. 每3d用紫外分光光度计测量一次藻在645nm波长处的吸光值并用血球计数方法测定藻细胞密度[8,9]，将所得结果通过EXCEL软件绘制铜绿微囊藻的生长曲线，确定藻细胞浓度与OD值之间的回归方程。

1.2.2 确定半效致死浓度(EC50)

取培养至对数生长期的铜绿微囊藻，接种4mL藻液至100mLBG-11液体培养基中，必须有明显绿色，向藻液中加入不同浓度的H2O2.铜绿微囊藻中H2O2的浓度梯度设置为0.000176m mol/L，0.000704m mol/L，0.00282m mol/L，0.0113m mol/L，0.0451m mol/L；另有空白比色组(只加100mLlBG11培养基)和对照组(只含培养基和铜绿微囊藻)。每组设3个平行，连续培养10d，每48h测量OD645，从第0 d开始测量。通过计算各浓度抑藻百分数，找出H2O2对铜绿微囊藻的半效致死浓度范围[10]。

1.2.3 MDA含量以及SOD、CAT、POD活性的测定

不同浓度H2O2处理铜绿微囊藻第六天，测藻体内MDA含量以及SOD、POD、CAT活性，丙二醛含量以及SOD、POD、CAT活力测定方法参见文献[11]。

2 结果与分析

2.1 藻细胞密度与吸光值的关系

图1 铜绿微囊藻细胞密度与吸光值关系

图2 H2O2对铜绿微囊藻的抑制率

铜绿微囊藻细胞密度与吸光值之间的关系见图1，回归方程为y=957.32x-12.12(y:铜绿微囊藻细胞个数，单位：104个；x：645nm波长下的吸光值)。相关系数R2=0.989，表明铜绿微囊藻细胞密度与吸光值的关系可信度较高，可以当作以后实验计算铜绿微囊藻细胞密度的计算公式。

2.2 EC50测定结果

H2O2对铜绿微囊藻的抑制率实验结果如图2所示，表明在0.000176～0.000704m mol/L浓度范围内，H2O2对铜绿微囊藻的生长起促进作用。0.00282～0.0451m mol/L浓度范围内，H2O2对铜绿微囊藻的生长起抑制作用，并且随着H2O2浓度的增加，抑制作用越来越强。通过计算得出H2O2对铜绿微囊藻的72h半效致死浓度为0.0417m mol/L.

2.3 H2O2对铜绿微囊藻MDA含量的影响

H2O2浓度/Concentration of H2O2/(m mol/L)

H2O2对铜绿微囊藻MDA含量的影响如图3所示，所有经H2O2处理的实验组藻细胞中MDA含量均高于对照组，并且随H2O2浓度上升铜绿微囊藻体内MDA含量逐渐升高。

2.4 H2O2对铜绿微囊藻SOD、POD、CAT活性的影响

不同浓度H2O2处理铜绿微囊藻SOD活性的变化如图4所示，H2O2浓度在0～0.00282m mol/L之间铜绿微囊藻中SOD的活性缓慢增强，在0.00282～0.0451m mol/L之间铜绿微囊藻中SOD的活性迅速增强。整体来看，随着H2O2浓度的增加，铜绿微囊藻中SOD的活性逐渐增强。

不同浓度H2O2处理铜绿微囊藻POD活性的变化如图5所示，铜绿微囊藻中的POD活性较高，加入H2O2后，POD的活性进一步增强。在0.000176～0.0451m mol/L间，随着H2O2浓度的增加，铜绿微囊藻中POD的活性逐渐增强。

不同浓度H2O2处理铜绿微囊藻CAT活性的变化如图6所示，随着H2O2浓度增大，铜绿微囊藻中CAT的活性逐渐增强。H2O2浓度在0.000704～0.00282 m mol/L间，铜绿微囊藻中CAT的活性有个陡增的过程。

H2O2浓度/Concentration of H2O2/(m mol/L)

3 讨论

3.1 H2O2对藻细胞生长的影响

本研究发现，H2O2处理藻液后，会对铜绿微囊藻藻细胞产生严重的损伤效应，从而对铜绿微囊藻的生长产生抑制作用，因此，可以应用H2O2来杀灭铜绿微囊藻，H2O2是一种潜在的除藻剂。不同浓度的H2O2处理藻液后，会对藻细胞产生不同程度的毒害作用。这是由于H2O2本身是一种ROS物质，当藻细胞受到氧化胁迫时，细胞膜脂质会发生过氧化作用而受到损伤，破坏细胞膜结构，从而对藻细胞产生毒害作用，当藻液中H2O2浓度越大，其毒害作用就越大。KAY S H等[12]的研究结果显示，H2O2对水产养殖是一种潜在的除藻药剂，建议在实际应用中，要在一定时间内达到有效抑制藻类效果，H2O2的质量分数应为0.004‰以上。本文研究结果也发现，H2O2对铜绿微囊藻的抑制率与H2O2的浓度成正比，并且H2O2对铜绿微囊藻的72h半效致死浓度为0.0417m mol/L.

3.2 H2O2对藻细胞生理的影响

H2O2对铜绿微囊藻的损伤效应还表现在对藻细胞的生理指标及抗氧化防御系统的影响。本研究发现，H2O2处理藻液第六天，测量铜绿微囊藻藻细胞内MDA含量，在实验的H2O2浓度范围内，随着H2O2浓度的增加，铜绿微囊藻藻细胞内MDA含量逐渐增加。MDA是细胞膜发生脂质过氧化的产物，说明H2O2使铜绿微囊藻发生了脂质过氧化，并且H2O2浓度越高，脂质过氧化作用越强，说明藻细胞的损伤效应越大。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)均是藻细胞内的抗氧化防御体系的酶，当藻细胞受到氧化损伤时，一定程度上会刺激藻细胞提高这三种酶的活性来抑制氧化损伤。本研究结果也显示，H2O2处理铜绿微囊藻，这三种酶的活性都增大，说明这三种酶与铜绿微囊藻藻细胞抗氧化能力密切相关。

本研究中，铜绿微囊藻在H2O2的胁迫生长过程中，藻细胞内三种保护酶SOD、CAT、POD的活性均发生了变化，丙二醛的含量也发生了相应的改变。在这三种酶活性测定以及丙二醛MDA含量的测定中，结果显示经过过氧化氢处理后藻细胞对其有一定的抗逆性，藻体内会自行产生一些防御机制。

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TheeffectsofH2O2onthegrowthandphysiologicalcharacteristicsofMicrocystisaeruginosa

QIU Chang-en，WANG Wei-dong

(College of Life Sciences, National Demonstration Center for Experimental Biology Education, Hubei Normal University, Huangshi 435002, China)

The effects of H2O2on the growth and physiological characteristics ofMicrocystisaeruginosawere studied. The results showed that the density of algal cells was proportional to the absorbance at the wavelength of 645nm. The regression equation wasy=957.32x-12.12andR2=0.989. In the experimental concentration range, with the increase of H2O2concentration, the contents of malondialdehyde (MDA) and the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) inMicrocystisaeruginosawere increased gradually. The 72h EC50 of H2O2onMicrocystisaeruginosawas 0.0417m mol/L.

hydrogen perioxide;Microcystisaeruginosa; EC50; growth; physiological characteristics

Q17

2096-3149(2017)04- 0001-05

10.3969/j.issn.2096-3149.2017.04.001

2017—03—15

邱昌恩(1966— )，男，湖北鄂州市人，博士，教授，研究方向为藻类生物技术和环境科学.