葛根素对妊娠期糖尿病大鼠胰腺组织let-7f及免疫因子IL-17、IL-23表达的影响①

刘奇云 马 敬 陶艳萍 敬晓涛

(昆明医科大学第一附属医院，昆明 650000)

葛根素对妊娠期糖尿病大鼠胰腺组织let-7f及免疫因子IL-17、IL-23表达的影响①

刘奇云 马 敬②陶艳萍 敬晓涛

(昆明医科大学第一附属医院，昆明 650000)

目的探究葛根素对妊娠期糖尿病大鼠胰腺组织let-7f及免疫因子IL-17、IL-23表达的影响。方法将120只大鼠分为正常对照组、空白对照组、辛伐他汀组、葛根素低剂量组、葛根素中剂量组、葛根素高剂量组，正常对照组以基础饲料、其他组以高脂饲料饲喂2周。辛伐他汀组给予2 mg/kg的辛伐他汀，葛根素组按低、中、高剂量分别给予70 mg/kg、120 mg/kg、170 mg/kg葛根素，正常对照组和空白对照组给予等量生理盐水，治疗2周后，测定6组大鼠血糖和血脂水平、胰腺组织中let-7f的表达水平以及血清和胰腺组织中IL-17和IL-23的表达情况。结果治疗后，辛伐他汀组和葛根素组大鼠的FBG、TC 、TG 、FFA显著低于空白对照组，且随着葛根素剂量的增加，FBG、TC 、TG 、FFA的水平显著降低(P<0.05)，呈剂量依赖性；辛伐他汀组和葛根素组胰腺组织中let-7f的表达显著高于空白对照组(P<0.05)，且呈剂量依赖性；辛伐他汀组和葛根素组血清和胰腺组织中IL-17和IL-23的表达显著高于空白对照组(P<0.05)，且呈剂量依赖性。结论葛根素能提高妊娠期糖尿病大鼠胰腺组织let-7f表达，同时降低血清和胰腺组织中IL-17、IL-23表达，为妊娠期糖尿病临床治疗提供新的思路和理论依据。

妊娠期糖尿病；葛根素；let-7f；白细胞介素17；白细胞介素23

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期常见的并发症[1]，对产妇的身体健康和胎儿的生命安全构成严重的威胁[2]。GDM临床主要表现为高血糖、多饮、多食、多尿[3]。GDM发病机制比较复杂，其中高龄妊娠、脂肪细胞因子、炎症因子和遗传因素是引发GDM的主要因素[4]。目前常用的控制妊娠期高血糖的药物有二甲双胍和格列本脲，然而二甲双胍的安全性研究尚缺乏，而且长期服用格列本脲会引发无症状低血糖[5]。葛根素作为一种植物类药物，近年来被广泛应用于糖尿病的治疗中，且临床疗效显著。本研究旨在探讨葛根素治疗妊娠期糖尿病对胰腺组织中let-7f及免疫因子IL-17和IL-23的表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及饲料 健康SD大鼠150只，SPF级，雌雄各半，8～10周龄，体重(150±20)g，购自北京实验动物研究中心[许可证号：SYXK(京)2015-0046]。普通饲料和高脂饲料由北京实验动物研究中心提供，高脂饲料的配方为[17]：基础饲料84.5%、蛋黄粉10%、猪油5%、胆酸钠0.5%。

1.1.2主要材料与仪器 辛伐他汀(国药准字H20123114，山西华元医药生物技术有限公司)；葛根素(批号：HS100301，安康禾烨麦迪森植物药业有限公司)；RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶购自NEB公司；兔抗大鼠IL-17多克隆抗体和兔抗大鼠IL-23多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；IL-17 ELISA试剂盒和IL-23 ELISA试剂盒购自上海赛默科技生物发展有限公司；PUZS-300全自动生化分析仪购自普朗医疗；3K15超低温离心机购自德国Sigma公司；SW-CJ-2D2G2F2FD 双人净化工作台购自苏州苏净；引物序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2方法

1.2.1妊娠期糖尿病动物模型建立 将雌性和雄性大鼠按1∶1合笼，次日清晨取雌性大鼠的阴道分泌物涂片镜检，发现精子则记为妊娠(弃去未怀孕大鼠)，从中随机选取20只孕鼠，记为正常对照组(怀孕但没有糖尿病)，用普通饲料饲喂2周，另外的130只孕鼠用高脂饲料饲喂2周后，测定非空腹血糖值,以血糖值≥6.7 mmol/L为妊娠期糖尿病大鼠模型建立成功的标准[6]。弃去空腹血糖未达标大鼠。

1.2.2实验分组及给药方案 将100只建模成功的妊娠期糖尿病大鼠随机分成5组，每组20只，分别命名为空白对照组、辛伐他汀组、葛根素低剂量组、葛根素中剂量组、葛根素高剂量组，辛伐他汀组给予2 mg/kg的辛伐他汀灌胃治疗，葛根素组按低、中、高剂量分别给予70、120、170 mg/kg葛根素灌胃治疗，正常对照组和空白对照组给予等容积0.9%的生理盐水灌胃治疗，每组治疗时间均为2周。

1.2.36组大鼠空腹血糖和血脂比较 在给药治疗后，测定6组大鼠空腹血糖和血脂情况。将6组大鼠禁食12 h，于次日清晨采集各组大鼠眼眶静脉血，置于超低温离心机，3 000 r/min离心5 min，分离血清。用全自动生化分析仪测定大鼠空腹血糖(FBG)和血脂[总胆固醇(TC) 、甘油三酯(TG) 、游离脂肪酸(FFA) ]的含量。

1.2.4大鼠胰腺组织分离 大鼠禁食12 h后行脱颈椎处死，将其置于75%酒精中消毒2～3 min，置于超净台内剪开大鼠腹腔，用镊子轻轻夹起脾脏，从靠近脾脏的胰尾分离至十二指肠处，将胰腺完整剪下，轻轻放入5 ml 4℃预冷的PBS溶液中，减去脂肪组织、血管、系膜和淋巴等，清洗2～3次后，置于4℃预冷的PBS溶液中备用。

1.2.5qRT-PCR检测胰腺组织中let-7f的表达水平 用RNA提取试剂盒，提取胰腺组织的总RNA，用反转录试剂盒将RNA反转为cDNA。然后根据NCBI上提交的let-7f序列(NR_031806.1)设计引物，上游引物F：5′-ATCAGAGTGAGGTAGTAGATTG-3′，下游引物R：5′-CTCGGGAAGGCAATAGAT-3′，进行qRT-PCR，同时以GAPDH为内参。PCR的反应体系为：5×缓冲液 10 μl，TaqDNA聚合酶 1 μl，上游引物F 2 μl，下游引物R 2 μl，10 mmol/L dNTP mix 1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 33 μl；PCR的反应条件为：预变性：95℃ 5 min，变性：95℃ 30 s，退火：61℃ 15 s(let-7f和GAPDH)，延伸：72℃ 1 min，30个循环，再延伸：72℃ 5 min。PCR 产物经电泳后计算 let-7f mRNA/GAPDH mRNA 的电泳条带积分光密度比值，用来表示let-7f mRNA 的相对值。

1.2.6免疫组化检测胰腺组织中IL-17和IL-23的表达水平 选取1.2.4中分离的胰腺组织制作石蜡切片(厚度不超过5 mm)，将组织切片在92～98℃条件下存放20 min进行抗原修复，滴加正常山羊血清用来中和非特异性反应后，在组织玻片上分别滴加IL-17和IL-23一抗，于4℃过夜放置，复温后再组织玻片上滴加二抗。使用DAB 显色试剂进行底物显色，当呈现金黄色时终止显色反应，使用苏木素进行复染后，用Olympus CCD摄像机随机采集1个视野(×200)的图片，观察IL-17和IL-23在细胞核和(或)胞质中的表达情况。

1.2.7ELISA检测血清中IL-17和IL-23的表达水平 治疗结束后，6组大鼠禁食12 h，于次日清晨采集各组大鼠眼眶静脉血，于超低温离心机，3 000 r/min离心5 min，分离血清。采用IL-17 ELISA试剂盒和IL-23 ELISA试剂盒检测大鼠血清中IL-17和IL-23的表达情况，具体操作步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行。将抗大鼠IL-17及IL-23单抗(一抗)滴加在酶标板上，随后加入生物素化的抗大鼠 IL-6、IL-17 及IL-23(二抗)，与结合在单抗上的IL-17和IL-23结合而形成免疫复合物。加入辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链球菌(Streptavidin)将与二抗的生物素结合，加入终止液后，在450 nm处测量其OD值，通过计算获得相应的浓度值。

1.2.8Western blot检测胰腺组织中IL-17和IL-23的表达水平 取1.2.4中分离的大鼠胰腺组织，加入2 ml细胞裂解液提取细胞总蛋白，以GAPDH为内参，采用Western blot方法检测IL-17和IL-23蛋白表达水平，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行定性分析，然后采用BCA Protein Assay Kit试剂盒测定蛋白浓度，操作方法按照试剂盒说明书。

2 结果

2.16组大鼠空腹血糖和血脂比较 持续治疗2周后，辛伐他汀组和葛根素组大鼠的FBG、TC、TG、FFA显著低于空白对照组(P<0.05)；且随着葛根素剂量的增加，FBG、TC 、TG 、FFA的水平显著降低(P< 0.05)，呈剂量依赖性； 葛根素高剂量组大鼠的FBG、TC、TG、FFA与正常对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05) ，结果见图1、2。

图1 6组大鼠空腹血糖比较Fig.1 Comparison of fasting blood glucose between 6 groups of rats(±s)Note:Compared with the normal control group，*.P<0.05;compared with the control group，#.P<0.05 compared with the simvastatin group，△.P<0.05;compared with the puerarin low-dose group，▲.P<0.05;compared with the puerarin medium-dose group，&.P<0.05.

2.2qRT-PCR检测胰腺组织中let-7f的表达水平 持续治疗2周后，空白对照组let-7f的表达水平显著低于正常对照组(P<0.05)；辛伐他汀组和葛根素组let-7f的表达水平显著低于空白对照组(P<0.05)，且随着葛根素剂量的增加，let-7f的表达水平显著提高(P<0.05)；葛根素高剂量组let-7f的表达与正常对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，结果见图3。

2.3免疫组化检测胰腺组织中IL-17和IL-23的表达水平 持续治疗2周后，与正常对照组相比，空白对照组胰腺组织中IL-17和IL-23的表达明显提高，表明妊娠期糖尿病大鼠胰腺组织中IL-17和IL-23的表达较高；与空白对照组相比，辛伐他汀组和葛根素组胰腺组织中IL-17和IL-23的表达明显降低，且随着葛根素剂量的提高胰腺组织中IL-17和IL-23的表达明显降低，结果如图4、图5所示。

图2 6组大鼠空腹血脂比较Fig.2 Comparison of fasting blood lipid between 6 groups of ratsNote:Compared with the normal control group，*.P<0.05;compared with the control group，#.P<0.05 compared with the simvastatin group，△.P<0.05;compared with the puerarin low-dose group，▲.P<0.05;compared with the puerarin medium-dose group，&.P<0.05.

图3 qRT-PCR检测胰腺组织中let-7f的表达Fig.3 qRT-PCR was used to detect the expression of let-7f in pancreatic tissueNote:Compared with the normal control group，*.P<0.05;compared with the control group，#.P<0.05 compared with the simvastatin group，△.P<0.05;compared with the puerarin low-dose group，▲.P<0.05;compared with the puerarin medium-dose group，&.P<0.05.

2.4ELISA检测血清中IL-17和IL-23的表达水平 持续治疗2周后，空白对照组大鼠血清中IL-17和IL-23的表达水平显著低于正常对照组(P<0.05)，辛伐他汀组和葛根素组血清中IL-17和IL-23的表达水平显著高于空白对照组(P<0.05)，且随着葛根素剂量的增加，大鼠血清中IL-17和IL-23的表达水平显著提高(P<0.05)；葛根素高剂量组血清中IL-17和IL-23的表达水平与正常对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，结果见图6。

图4 免疫组化检测胰腺组织中IL-17的表达水平(×200)Fig.4 Expression level of IL-17 in pancreatic tissue was detected by immunohistochemistry (×200)Note:A.Normal control group；B.The blank control group;C.Simvastatin group；D.Puerarin low-dose group；E.Puerarin medium-dose group；F.Puerarin high-dose group.

2.5Western blot检测胰腺组织中IL-17和IL-23的表达水平 持续治疗2周后，空白对照组胰腺组织中IL-17和IL-23的表达水平显著高于正常对照组(P<0.05)，辛伐他汀组和葛根素组胰腺组织中IL-17和IL-23的表达水平显著高于空白对照组(P<0.05)，且随着葛根素剂量的增加，大鼠胰腺组织中IL-17和IL-23的表达显著提高(P<0.05)；葛根素高剂量组胰腺组织中IL-17和IL-23的表达水平与正常对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，结果见图7。

图6 ELISA检测血清中IL-17和IL-23的表达水平Fig.6 ELISA was used to detect expression of IL-17 and IL-23 in serum(±s)Note: Compared with the normal control group，*.P<0.05；compared with the blank control group，#.P<0.05；compared with the simvastatin group，△.P<0.05；compared with the puerarin low-dose group，▲.P<0.05；compared with the puerarin medium-dose group，&.P<0.05.

图7 Western blot检测胰腺组织中IL-17和IL-23的表达水平Fig.7 Western blot examined expression levels of IL-17 and IL-23 in pancreatic tissue(±s)Note: Compared with the normal control group，*.P<0.05;compared with the control group，#.P<0.05 compared with the simvastatin group，△.P<0.05;compared with the puerarin low-dose group，▲.P<0.05;compared with the puerarin medium-dose group，&.P<0.05.

3 讨论

葛根素(Puerarin，Pue)是从豆科植物葛根中提取出来的天然活性物质，临床上主要用于治疗2型糖尿病[7]，其主要有效成分为异黄酮。Pue具有良好的扩张血管、增强免疫力、抗氧化、降血糖和提高胰岛素受体细胞敏感性等功能[8-10]。近年来，不少学者将Pue应用于糖尿病的治疗中。研究表明，Pue可以降低链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠的血糖水平[11]。Pue还可以用于糖尿病心血管并发症的治疗中，腹腔注射Pue在降低糖尿病大鼠血糖水平的同时，还可以抑制血清心肌酶(CK-MB)和心肌组织中RAGE mRNA的表达[12]。刘娇梅[13]的研究表明Pue对糖尿病大鼠具有保护作用，而且呈现剂量依赖性。本研究表明，葛根素能够显著降低妊娠期糖尿病大鼠血糖和血脂水平，且呈现剂量依赖性，这与前人的研究结果一致。但葛根素对妊娠期糖尿病胰腺组织中let-7f及免疫因子IL-17和IL-23表达水平的影响尚未见报道。

miRNA let-7家族是在秀丽隐杆线虫体内被发现的[14，15]，它可以通过调节葡萄糖代谢和胰岛素的分泌调控糖尿病的发生。研究表明，过量表达let-7的转基因小鼠会出现葡萄糖耐量受损和胰岛素分泌减少[16]。Zhu等[17]的研究表明，let-7过表达会产生胰岛素抵抗和葡萄糖耐量受损，同时他们还验证了let-7抑制的靶基因有 IGF1R、INSR、IRS2、HMGA2和 IGF2BP2，这些基因均与葡萄糖代谢及胰岛素分泌密切相关。miRNA let-7家族成员有12种，miRNA let-7f属于其中一种，研究表明，miRNAlet-7f在1型糖尿病小鼠内皮祖细胞(EPCs)中的表达水平降低，当血糖水平降低时let-7f的表达水平升高[18]。以上数据都说明let-7的表达与血糖水平呈负相关，本研究表明，let-7f在妊娠期糖尿病大鼠胰腺组织中的表达降低，当用不同剂量的Pue对妊娠期糖尿病大鼠进行治疗后，let-7f的表达水平逐渐升高，且呈现剂量依赖性。

白细胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)和白细胞介素-23(interleukin-23，IL-23)是一种重要的免疫因子，在机体的免疫和调控中发挥着重要的作用[19，20]。研究表明，IL-17能够诱导T细胞活化，进而刺激机体产生更多的促炎因子[21]。而IL-23是促进和维持Th17细胞分泌IL-17的重要免疫因子，通过IL-23/IL-17轴发挥作用。越来越多的证据表明IL-23/IL-17轴在自身免疫性疾病及炎性疾病中发挥重要的作用[22]。Mohamed等[23]研究发现，IL-17对糖尿病小鼠肾脏具有保护作用。且有临床试验发现，2型糖尿病肾病患者外周血中Th17的表达增多[24，25]。Abbasi等[26]的研究表明IL-23亚基mRNA在糖尿病患者外周血PBMC中表达水平较低。这些研究提示IL-17及IL-23在糖尿病的发生发展中具有重要作用。但免疫因子IL-17和IL-23在妊娠期糖尿病大鼠中的表达方面的研究尚未见报道。本研究结果表明，IL-17和IL-23在妊娠期糖尿病大鼠血清和胰腺组织中的都表达升高，表明IL-17和IL-23在妊娠期糖尿病大鼠血清和胰腺组织中的表达情况是一致的；当用不同剂量的Pue对妊娠期糖尿病大鼠进行治疗后，IL-17和IL-23的表达水平逐渐降低，且呈现剂量依赖性。另外还有研究表明[27]，let-7f负调节Th17细胞中IL-23R的表达和IL-17A的产生，因此其认为let-7f对IL-23、IL-17具有显著的调控作用。而本研究结果中，随着Pue剂量的增加，miRlet-7f呈现升高的趋势，而IL-23、IL-17呈现降低的趋势，推测可能是由于let-7f的负调节作用而导致IL-23及IL-17的产生，具体机制目前尚不明确，还有待进一步深入研究。

综上所述，葛根素能提高妊娠期糖尿病大鼠胰腺组织let-7f表达，同时降低血清和胰腺组织中IL-17、IL-23表达，为妊娠期糖尿病临床治疗提供新的思路和理论依据。

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Influenceofpuerarinonpancreatictissuelet-7fandimmunefactorsIL-17andIL-23expressionofratswithgestationaldiabetesmellitus

LIUQi-Yun,MAJing,TAOYan-Ping,JINGXiao-Tao.

FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650000,China

Objective:To explore the influence of puerarin on pancreatic tissue let-7f and immune factors IL-17 and IL-23 expression of rats with gestational diabetes mellitus.Methods120 cases of rats were divided into the normal control group,the blank control group,simvastatin group,puerarin low-dose group,puerarin medium-dose group and puerarin high-dose group.The normal control group were given basal diet,and the other groups were given high fat diet,all fed for two weeks.The simvastatin group were given 2 mg/kg simvastatin,and the puerarin group were given 70 mg/kg,120 mg/kg,170 mg/kg puerarin according to low,medium,high dose,and the normal control group and blank control group were given the same amount of normal saline,after 2 weeks of treatment,blood sugar and blood lipid and let-7f expression in pancreatic tissue of rats were tested in the six groups.ResultsAfter treatment,FBG,TC,TG and FFA of rats in the simvastatin group and puerarin group were significantly lower than those in the blank control group,and with the increasing of puerarin dose,the levels decreased significantly (P<0.05),in a dose-dependent manner.Let-7f expression in pancreatic tissue of the simvastatin group and puerarin group was significantly higher than that in the blank control group (P<0.05),in a dose-dependent manner.IL-17 and IL-23 expression in serum and pancreatic tissue of the simvastatin group and puerarin group was significantly higher than that of the blank control group (P<0.05),in a dose-dependent manner.ConclusionPuerarin can increase let-7f expression in pancreatic tissue of gestational diabetes mellitus rats with gestational diabetes mellitus,and can reduce IL-17 and IL-23 expression in serum and pancreatic tissue.It can provide reference for clinical treatment of gestational diabetes mellitus.

Gestational diabetes mellitus;Puerarin;let-7f;Interleukin 17;Interleukin 23

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.018

R714.256

A

1000-484X(2017)12-1843-06

①本文为国家自然科学基金地区项目(81460240)、云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项资金项目青年博士项目[2017FE467(-140)]和云南省卫生和计划生育委员会医学后备人才培养计划(H-201646)。

②通讯作者，E-mail：394632080@qq.com。

刘奇云(1982年-)，男，硕士，住院医师，主要从事围产医学研究，E-mail：314066987@qq.com。

[收稿2017-09-12 修回2017-11-02]

(编辑 倪 鹏)

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5)美国《乌利希期刊指南(网络版)》(UPD，Ulrich's Periodicals Directory)；

6)英国《国际农业与生物科学研究中心》(CABI，Centre for Agriculture and Bioscience International);

7)WHO西太平洋地区医学索引(Western Pacific Region Index Medicus,WPRIM)；

8)英国《公共健康研究数据库》(Global Health)。

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