表没食子儿茶素没食子酸酯对IFN-γ/LPS刺激的小鼠髓源性巨噬细胞极化的影响①

王卫芳 王 慧 张晓静 崔梦珂 李卫国 王坤英

(河南师范大学生命科学学院，新乡 453007)

表没食子儿茶素没食子酸酯对IFN-γ/LPS刺激的小鼠髓源性巨噬细胞极化的影响①

王卫芳 王 慧 张晓静 崔梦珂 李卫国 王坤英

(河南师范大学生命科学学院，新乡 453007)

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对IFN-γ/LPS刺激的小鼠髓源性巨噬细胞促炎细胞因子表达的影响。方法取6～8周龄C57BL/6小鼠骨髓细胞，经100 ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)体外诱导分化为骨髓巨噬细胞(BMDM)，加入50 ng/ml干扰素γ(IFN-γ)和1 μg/ml细菌脂多糖(LPS)刺激，并同时暴露于12.5～50 μmol/L EGCG处理48 h，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测巨噬细胞促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA表达水平和蛋白含量。结果IFN-γ和LPS处理可刺激巨噬细胞IL-1β、TNF-α和iNOS表达显著上调，而EGCG则能抑制IFN-γ和LPS刺激的IL-1β、TNF-α和iNOS表达，且存在剂量依赖性。结论EGCG能够减弱IFN-γ和LPS刺激的髓源性巨噬细胞的促炎作用。

髓源性巨噬细胞；表没食子儿茶素没食子酸酯；巨噬细胞极化

巨噬细胞是一类具有高度异质性和可塑性的细胞群体，浸润于机体的大多数组织中，发挥着不同的作用[1]。起源于骨髓的单核细胞，经血液循环进入组织分化为巨噬细胞，在所处微环境因子的刺激下进一步分化[2]。巨噬细胞极化分为经典活化型巨噬细胞(M1)和替代活化型巨噬细胞(M2)。M1巨噬细胞由γ干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)、细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导产生，可分泌多种促炎细胞因子和炎性介质，如肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor α,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthesis,iNOS)等，通过清除病原体、坏死组织和激活其他免疫细胞以利于机体抵御感染。M2巨噬细胞由IL-4、IL-13诱导产生，与炎症消退、肿瘤生长维持、抗肠道寄生虫感染有关，并参与组织修复等[3]。M1/M2型巨噬细胞的分化与许多疾病的发生发展都密切相关，如Ⅱ型糖尿病、胰岛素抵抗、癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等[4]。

表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶多酚的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种生物学效应[5-7]。Jang等[8]研究发现经EGCG处理的小鼠乳腺癌细胞系4T1能下调M2巨噬细胞的TGF-β分泌，表明EGCG能影响肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAM)的极化。本实验室的研究表明EGCG抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞促炎因子TNF-α和IL-1β基因表达和生成，并能影响IL-4刺激的小鼠腹腔巨噬细胞精氨酸酶-1(Arginase,Arg-1)和诱导性一氧化氮合酶(iNOS)表达[9，10]。但是，EGCG能否影响小鼠髓源性巨噬细胞(Myeloid macrophages)极化，未见研究报道。本研究将通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测巨噬细胞促炎因子TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA水平和蛋白生成，探讨EGCG对髓源性巨噬细胞极化的影响作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 实验选用6～8周龄、体重(20±3)g的清洁级C57BL/6小鼠，雌雄比例1∶1，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。正常膳食喂养，光照∶黑暗为12 h∶12 h。

1.1.2主要试剂 实验使用的RPMI1640培养液为HyClone公司产品，血清为四季青公司产品，红细胞裂解液为Solarbio公司产品，重组小鼠M-CSF为R&D公司产品，IFN-γ为PeproTech公司产品，RNAiso Plus和cDNA第一合成试剂盒为TaKaRa公司产品，qRT-PCR试剂盒为Vazyme Biotech公司产品，qRT-PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，IL-1β、TNF-α和iNOS的ELISA试剂盒为南京森贝伽生物科技有限公司产品。

1.2实验方法

1.2.1小鼠骨髓细胞分离培养 将小鼠颈椎脱臼处死后，无菌条件下分离股骨和胫骨，用完全培养基将骨髓内容物吹入无菌平皿内分散均匀。离心、弃上清后，加入红细胞裂解液裂解红细胞，30 s后用完全培养基终止裂解。经离心、重悬后，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h，收集未贴壁的骨髓细胞。

1.2.2髓源性巨噬细胞的诱导和分组处理 将收集的骨髓细胞铺于6孔细胞培养板中，1×106个细胞/孔。按实验设计将骨髓细胞分为5组，即对照组、LPS/IFN-γ处理组以及3个LPS/IFN-γ与EGCG共处理组。依Ying等[11]的方法，各组骨髓细胞经100 ng/ml M-CSF诱导7 d分化为巨噬细胞，第3天时更换含M-CSF的新鲜培养液一次。在M-CSF诱导第5天时，LPS/IFN-γ处理组加入1 μg/ml LPS和50 ng/ml IFN-γ培养48 h，而3个LPS/IFN-γ与EGCG共处理组则在加入1 μg/ml LPS和50 ng/ml IFN-γ的同时分别加入12.5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L的EGCG培养48 h。

1.2.3巨噬细胞促炎细胞因子mRNA水平的qRT-PCR分析 收集诱导处理7 d后的细胞，提取RNA，并按反转录试剂盒操作说明，去除基因组DNA，进行cDNA第一链的合成，并置于4℃保存。按照标准qRT-PCR引物设计原则，运用primer 5.0软件设计IL-1β、TNF-α和iNOS的引物序列(表1)。

qRT-PCR反应按两步法标准程序设置：95℃预变性5 min，95℃变性10 s、退火60 s、延伸30 s，共40个循环。然后依照qRT-PCR试剂盒操作说明在罗氏Light Cycler®96荧光定量PCR仪上完成实验。实验所得数据则按照2-ΔΔCt法进行计算，并进行统计学分析。

1.2.4巨噬细胞促炎细胞因子含量的ELISA检测 收集诱导处理7 d后的细胞培养液放入-80℃冰箱，以备ELISA法检测细胞IL-1β和TNF-α的分泌量。然后用预热PBS清洗后，按照6孔板每孔加入200 μl细胞裂解液，混匀后，10 000～14 000 g离心3～5 min，取上清用ELISA试剂盒检测iNOS含量。

2 结果

2.1EGCG抑制IFN-γ/LPS刺激的髓源性巨噬细胞IL-1β基因表达和蛋白生成 小鼠骨髓细胞经100 ng/ml M-CSF诱导分化为髓源性巨噬细胞。运用qRT-PCR分析表明，与对照组巨噬细胞相比，经50 ng/ml IFN-γ和1 μg/ml LPS联合处理的巨噬细胞IL-1β mRNA表达水平极显著地上调，存在极显著性差异；与50 ng/ml IFN-γ和1 μg/ml LPS联合处理组细胞相比，12.5～50 μmol/L EGCG处理可抑制IFN-γ/LPS诱导的巨噬细胞IL-1β基因表达上调，12.5 μmol/L EGCG处理组细胞的IL-1β mRNA水平显著下调(P<0.05)，而25 μmol/L和50 μmol/L EGCG处理组细胞的IL-1β mRNA水平呈极显著下调(P<0.01)(图1A)。运用ELISA技术检测显示，与对照组巨噬细胞相比，50 ng/ml IFN-γ和1 μg/ml LPS联合刺激可使髓源性巨噬细胞的IL-1β蛋白生成极显著性增加(P<0.01)，而12.5～50 μmol/LEGCG处理可极显著性地抑制IFN-γ和LPS联合刺激的IL-1β生成(P<0.01)(图1B)。这些结果提示EGCG能够抑制IFN-γ和LPS联合刺激的小鼠髓源性M1巨噬细胞的IL-1β表达和生成，且存在剂量依赖效应。

表1IL-1β、TNF-α和iNOS基因的引物序列

Tab.1PrimersequencesofIL-1β,TNF-αandiNOSgene

GenePrimers5'→3'IL-1βForward:CAGGCAGTATCACTCATT-GTGGCIL-1βReverse:CAGCAGGTTATCATCAT-CATCCCTNF-αForward:GAGTGACAAGCCTGTAGCCTNF-αReverse:CTCCTGGTATGAGATAG-CAAAiNOSForward:CACCAAGCTGAACTT-GAGCGiNOSReverse:GTGGCTTTGGGCTCCTCβ-actinForward:CGTCAGGCAGCTCAT-AGCTCTTCTβ-actinReverse:TGGCTACAGCTTCACCAC-CACAG

图1 EGCG抑制IFN-γ/LPS刺激的小鼠髓源性巨噬细胞IL-1β基因表达和生成Fig.1 EGCG inhibits IL-1β gene expression and IL-1β production stimulated by IFN-γ/LPS in murine myeloid macrophagesNote: The myeloid cells were isolated from bone marrow,cultured with RPMI1640 medium contained 10% FBS.After induced with M-CSF(100 ng/ml)for 7 days,the myeloid cells differentiated into the myeloid macrophages.At 5th day,the myeloid macrophages were induced to M1 macrophage stimulated with 50 ng/ml IFN-γ and 1 μg/ml LPS,and at the same time,these cells were treated with 12.5 μmol/L,25 μmol/L,and 50 μmol/L EGCG for 48 h,respectively.After macrophages were harvested,the IL-1β mRNA level was analyzed with qRT-PCR(A),and the IL-1β level was detected with ELISA(B).**.P<0.01,compared with control;#.P<0.05 and ##.P<0.01,compared with IFN-γ+LPS group.

2.2EGCG抑制IFN-γ/LPS刺激的小鼠髓源性巨噬细胞TNF-α基因表达及生成 体外分离培养的小鼠骨髓细胞经M-CSF诱导分化为髓源性巨噬细胞，进一步在IFN-γ和LPS刺激下，分化为M1型巨噬细胞，并分泌细胞因子TNF-α。运用qRT-PCR分析表明，M-CSF单独诱导的对照组髓源性巨噬细胞TNF-α mRNA几乎不表达，经IFN-γ和LPS联合刺激后，髓源性巨噬细胞的TNF-α mRNA水平极显著性的增加(P<0.01)；与IFN-γ和LPS联合刺激组的髓源性巨噬细胞相比，12.5～50 μmol/L EGCG处理后，巨噬细胞的TNF-α mRNA水平出现下降，且在50 μmol/L EGCG处理时下降最为明显，呈现剂量依赖效应(图2A)。运用ELISA检测显示，与对照组巨噬细胞相比，IFN-γ和LPS联合刺激组的巨噬细胞TNF-α生成量极显著性增加(P<0.01)；而经12.5～50 μmol/L EGCG 处理后，巨噬细胞TNF-α生成量出现极显著性下降(P<0.01)(图2B)。这些结果提示EGCG能够抑制IFN-γ和LPS联合刺激的小鼠髓源性M1巨噬细胞的TNF-α表达和生成，且存在剂量依赖效应。

图2 EGCG抑制IFN-γ/LPS刺激的小鼠髓源性巨噬细胞TNF-α基因表达和生成Fig.2 EGCG represses TNF-α gene expression and TNF-α production stimulated by IFN-γ/LPS in mlurine myeloid macrophagesNote: The experimental method is same as Fig 1.After macrophages were harvested,the TNF-α mRNA level was analyzed with qRT-PCR(A),and the TNF-α level was detected with ELISA(B).**.P<0.01,compared with control;##.P<0.01,compared with IFN-γ+LPS group.

图3 EGCG抑制IFN-γ/LPS刺激的小鼠髓源性巨噬细胞iNOS基因表达和生成Fig.3 EGCG decreases iNOS gene expression and iNOS production stimulated by IFN-γ/LPS in murine myeloid macrophagesNote: The experimental method is same as Fig 1.After macrophages were harvested,the iNOS mRNA level was analyzed with qRT-PCR(A),and the iNOS level was detected with ELISA(B).**.P<0.01,compared with control;##.P<0.01,compared with IFN-γ+LPS group.

2.3EGCG抑制IFN-γ/LPS刺激的小鼠髓源性巨噬细胞iNOS基因表达及生成 巨噬细胞在IFN-γ或LPS的刺激下极化为M1型巨噬细胞，高表达iNOS，并产生NO，因而iNOS是M1型巨噬细胞的重要标志物。运用qRT-PCR分析表明，经M-CSF单独诱导的对照组髓源性巨噬细胞iNOS mRNA几乎不表达，经IFN-γ和LPS联合刺激后，髓源性巨噬细胞的iNOS mRNA水平极显著性增加(P<0.01)；与IFN-γ和LPS联合刺激组的髓源性巨噬细胞相比，12.5～50 μmol/L EGCG处理后，巨噬细胞的iNOS mRNA水平出现下降，并随着EGCG浓度增加，下降幅度越大，呈现出明显的剂量依赖效应(图3A)。运用ELISA检测显示，与对照组巨噬细胞相比，IFN-γ和LPS联合刺激组的巨噬细胞iNOS生成量极显著性增加(P<0.01)；而经12.5～50 μmol/L EGCG 处理后，巨噬细胞iNOS生成量出现极显著性下降(P<0.01)(图3B)。这些结果提示EGCG能够抑制IFN-γ和LPS联合刺激的小鼠髓源性M1巨噬细胞的iNOS表达和生成，且存在剂量依赖效应。

3 讨论

众所周知，巨噬细胞极化是机体免疫系统维持免疫稳态的一个动态过程，某些特定疾病的发生条件与巨噬细胞极化密切相关，了解这些机制将有利于疾病的治疗[12]，而骨髓来源的巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDM)是研究巨噬细胞极化的适宜细胞模型[11]。巨噬细胞的发育与分化依赖于巨噬细胞集落刺激因子(Macrophages colony-stimulating factor,M-CSF)的诱导，骨髓细胞在M-CSF诱导下激活ERK1/2通路，促使骨髓前体细胞向巨噬细胞分化[13]；巨噬细胞在IFN-γ和LPS刺激下极化成M1型巨噬细胞。LPS能与巨噬细胞表面的Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)结合，经Akt1/2诱导巨噬细胞极化[14]，进而增强促炎细胞因子的基因表达和分泌[15，16]；而IFN-γ可进一步增强M1型巨噬细胞的活化。

在本实验中，M-CSF诱导小鼠骨髓细胞形成BMDM，后者在IFN-γ和LPS刺激下极化为M1型巨噬细胞，其分泌的IL-1β、TNF-α、iNOS在mRNA表达水平是增加的，并且具有极显著性差异。这与Ying等[11]的实验结果一致的，他们将小鼠骨髓细胞经M-CSF诱导形成髓源性巨噬细胞，IFN-γ和LPS刺激1周后，检测显示巨噬细胞的IL-1β、TNF-α表达水平显著上升；流式细胞术检测也显示巨噬细胞的表面标记物CD11b、F4/80、CD206表达增强；同时还发现细胞的p65可在IFN-γ和LPS刺激后活化，表明巨噬细胞极化与p65活化相关。本实验中，EGCG和LPS/IFN-γ共处理后，M1型巨噬细胞促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和iNOS表达下降，表明EGCG能降低LPS/IFN-γ刺激的巨噬细胞促炎细胞因子表达。

EGCG通过何种机制调控LPS/IFN-γ刺激的巨噬细胞促炎细胞因子表达和生成？有研究表明，EGCG可通过细胞膜表面的67 kD层黏连蛋白受体(67-kD laminin receptor,67 LR)机制介导促炎细胞因子的分泌[17]，EGCG不但通过67 LR抑制IKKβ活性进而阻断NF-κB通路的活化[18]，而且还能通过67 LR下调LPS刺激的巨噬细胞TLR4信号转导作用，抑制丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)的激活，进而减少促炎细胞因子的生成[19，20]。EGCG也可通过AMP激活的蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)抑制LPS刺激的促炎细胞因子TNF-α、IL-6和iNOS的生成[21]。有学者发现EGCG抑制LPS诱导的巨噬细胞产生NO时，还能够抑制Rab5与小凹蛋白-1(caveolin-1)的相互作用以及降低Rab5的活性，这些现象提示EGCG的这些作用是通过抑制LPS的内吞作用进而干扰Rab5与caveolin-1的相互作用和降低Rab5的活性实现的[22]。在THP-1巨噬细胞上的研究显示，EGCG抑制LPS刺激的IL-1β和TNF-α表达的机制并不仅仅依赖于经典的NF-κB、MAPK信号通路[23]，提示EGCG抗炎机制可能是通过多种信号通路组成的调控网络实现的，但这还需要更多的实验证据予以支持。

本研究表明EGCG能够下调IFN-γ和LPS刺激的髓源性巨噬细胞促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和iNOS表达，抑制巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，降低其炎性反应，这为EGCG在防治炎性疾病方面的潜在作用提供了一定的实验依据。

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Influenceofepigallocatechin-3-gallateonmyeloidmacrophagespolarizationinducedwithIFN-γ/LPSinmice

WANGWei-Fang,WANGHui,ZHANGXiao-Jing,CUIMeng-Ke,LIWei-Guo,WANGKun-Ying.

CollegeofLifeScience,HenanNormalUniversity,Xinxiang453007,China

Objective:To investigate the effect of epigallocatechin-3-gallate(EGCG)on the expression of pro-inflammatory cytokines in murine bone marrow-derived macrophages(BMDM)induced by IFN-γ/LPS.MethodsThe bone marrow cells were isolated from 6-8 weeks C57BL/6 mice,which cultured in RPMI1640 medium with 10% FBS and stimulated with 100 ng/ml M-CSFinvitro,and then exposed to 50 ng/ml IFN-γ and 1 μg/ml LPS with various concentrations of EGCG(12.5-50 μmol/L).The expression of pro-inflammatory factors,IL-1β,TNF-α and iNOS were detected,in murine myeloid macrophages stimulated by IFN-γ/LPS with qRT-PCR and ELISA.ResultsIFN-γ/LPS remarkably up-regulated the expression levels of inflammatory cytokines,IL-1β,TNF-α and iNOS,but EGCG effectively repressed these cytokines expression in IFN-γ/LPS-stimulated murine myeloid macrophages,in dose-dependent manner.ConclusionEGCG attenuates the pro-inflammatory phenotype of murine myeloid macrophages stimulated with IFN-γ/LPS.

Myeloid macrophages;Epigallocatechin-3-gallate;Macrophage polarization

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.011

R392.12

A

1000-484X(2017)12-1810-05

①本文受河南省重点科技攻关计划(No.122102310282)项目资助。

王卫芳(1990年-), 女, 在读硕士, 主要从事巨噬细胞极化方面的研究,E-mail:1475165901@qq.com。

及指导教师：李卫国(1963年-), 男, 博士, 教授, 硕士生导师, 主要从事细胞免疫学方面的研究，E-mail:liwg0618@ htu.cn。

[收稿2017-04-20 修回2017-06-29]

(编辑 张晓舟)