布鲁氏菌病患者中PD-1和PD-L1的表达①

庞 盼 张峰波 朱玥洁 贾 斌 张跃新 张春桃 甫拉提·热西提 丁剑冰

(新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐 830011)

布鲁氏菌病患者中PD-1和PD-L1的表达①

庞 盼 张峰波②朱玥洁③贾 斌④张跃新④张春桃 甫拉提·热西提 丁剑冰

(新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐 830011)

目的研究程序性死亡受体1(PD-1)/与配体(PD-L1)以及相关细胞因子转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)和白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)在布鲁氏菌病(Brucellosis)患者中的变化。方法选取60例布鲁氏菌病患者与60例健康志愿者，采用流式细胞术分别检测其外周血单个核细胞(PBMC)中CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞中PD-1的表达，以及树突状细胞(Dendritic cell，DC)中PD-L1的表达，同时采用流式液相多重蛋白定量技术(Cytometric bead array，CBA )检测血清中TGF-β和IL-10的变化，采用Pearson法分析布鲁氏菌病患者体内PD-1与TGF-β及IL-10的相关性，并对34例布鲁氏菌病治愈患者进行了追踪随访。结果与正常对照组相比，布鲁氏菌病患者组外周血中PD-1、PD-L1的表达及血清中TGF-β和IL-10的水平均明显升高(P<0.01),而治愈组外周血中PD-1、PD-L1的表达及血清中TGF-β和IL-10的水平较治疗前明显降低(P<0.01),并且布鲁氏菌病患者组PD-1的表达与TGF-β (r=0.817,P<0.01)及IL-10均呈正相关(r=0.835,P<0.01)。结论PD-1/PD-L1及TGF-β和IL-10在布鲁氏菌病患者体内高表达，可能共同参与了布鲁氏菌对宿主免疫应答的负性调控作用。

PD-1；PD-L1；布鲁氏菌病；细胞因子

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称“布病”，是由布鲁氏菌(Brucella)感染引起的人畜共患病，在我国牧区流行较为严重，新疆是该病的高发地区之一，目前研究发现布病的发生与宿主免疫功能下降有关[1-4]。 我们前期检测布病患者血清中可溶性负性协同刺激分子Tim-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein-3，Tim-3)和可溶性程序性死亡蛋白1(Programmed death-1，PD-1)，发现布病患者血清中sTim-3和sPD-1升高，并存在Th1/Th2细胞的失衡[5,6]。负性协同刺激分子PD-1以膜型和可溶型两种形式存在，属于CD28/细胞毒性T淋巴细胞抗原4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)免疫球蛋白超家族，主要表达于活化的T细胞表面，在抗感染免疫中可下调或抑制T细胞的活化和某些细胞因子的产生，增强免疫抑制功能，从而使宿主对病原体的清除能力减弱[7-9]。程序性死亡分子配体(Programmed death ligands，PD-L1，B7-H1) 主要表达于树突状细胞(Dendritic cell，DC)表面[10,11]。许多研究证实膜型PD-1和PD-L1在结核病、肝炎以及艾滋病等感染性疾病中发挥重要的免疫抑制作用[12-14],但其在布病中的作用机制目前未见报道。本研究采用流式细胞术检测布病患者组、治愈组以及健康对照组外周血中T细胞表面PD-1的表达，DC细胞表面PD-L1的表达，同时采用CBA检测TGF-β及IL-10的变化，分析负性免疫分子PD-1/PD-L1和TGF-β及IL-10在布病感染治疗前后的变化特点。

1 资料与方法

1.1资料 收集2016年1月～2017年4月在新疆医科大学第一附属医院感染科就诊的60例门诊患者，年龄5～80岁，中位年龄为45岁，其中男性患者49例，女性患者11例。收集34例布病患者治愈组，年龄6～78岁，中位年龄43岁，其中男性患者26例，女性患者8例。布病病例组纳入标准：布病的诊断参照2012年我国颁布的《布鲁氏菌病诊疗指南(试行)》标准[15]：有流行病学史，临床表现为发热、多汗、骨关节痛、睾丸痛、全身乏力等症状，血清学检查中虎红平板凝集试验阳性，试管凝集试验(SAT)滴度为1∶100及以上或菌培养阳性，排除伤寒、副伤寒、风湿热及结核、败血症等疾病。同时选取60例同期体检的健康人群作为正常对照组，年龄性别均与病例组无统计学差异。所有对照及患者均签署知情同意书，实验经新疆医科大学第一附属医院伦理学委员会批准(20150225-94)。

1.2方法

1.2.1样本处理 将收集到的60例布病患者组、34例治愈组以及60例对照组的全血标本均经2 000 r/min离心10 min,吸取上清于EP管中；将剩下的血细胞吸取至15 ml离心管中，加入与血细胞等体积的PBS用巴氏管轻轻吹打混匀，再取与血细胞等体积的淋巴细胞分离液(北京索莱宝|P8610|人外周血淋巴细胞分离液)注入50 ml离心管中，将与PBS充分混匀的血细胞用巴氏管沿管壁缓慢注入50 ml离心管中，2 000 r/min离心20 min，提取单核细胞。

1.2.2TGF-β和IL-10的检测 采用CBA技术检测60例布病患者组、34例治愈组和60例正常对照组血清中TGF-β和IL-10(Cytometric Bead Array Human TGF-β、IL-10 Cytokine Kit，BD公司)的水平，标准品梯度稀释浓度依次为 5 000、2 500、1 250、625、312.5、156、80、40、20、0 pg/ml，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪分析读取数据(流式细胞仪为德国美天旎生物技术有限公司产品)，根据标准曲线计算样品中TGF-β和IL-10的水平。

1.2.3PD-1和PD-L1的检测 用提取的单核细胞分别检测布鲁氏菌患者组、治愈组、对照组T细胞表面的PD-1和DC细胞表面的PD-L1。在T细胞流式管中分别加入APC标记的CD3、Percp 标记的CD4、FITC 标记的CD8、PE 标记的PD-1单克隆抗体，分别为1 μl、2 μl、2 μl、2 μl；在DC细胞流式管中分别加入Percp 标记的CD11c、PE 标记的PD-L1、PE-cy7 标记的HLA-DR 单克隆抗体各2 μl(所有流式单克隆抗体均购自BD公司，流式细胞仪为德国美天旎生物技术有限公司产品)，室温避光15 min 后，用PBS 洗涤2 次，PBS 重悬细胞，调整细胞密度为1×106ml-1。上机检测至少10 000 个细胞，采用FSC/SSC 双参数设门，分析PD-1;采用FSC/SSC 双参数设门，再用HLA-DR/CD11c设门，选定HLA-DR+CD11c+细胞即为DC，进一步分析DC表面PD-L1 表达情况。

2 结果

2.1布病患者基本资料情况 收集的60例布病患者均有流行病学史、经虎红实验阳性确诊为布病的患者。基本情况如表1、2所示。

2.2布病患者组、治愈组和正常对照组PD-1和PD-L1的表达 本研究用流式细胞仪分析T细胞表面PD-1，结果显示，与正常对照组相比，布病组PD-1在CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表面的表达均明显增高(P<0.01)，而治愈组PD-1在CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表面的表达较治疗前明显降低(P<0.01)。见表3，图1、2。

2.3布病患者组、治愈组和正常对照组血清中TGF-β和IL-10的水平 本研究用CBA法检测出布病患者组、治愈组和正常对照组血清中TGF-β的水平分别为(912.77±91.05)pg/ml、(418.19±63.40)pg/ml、(406.59±67.35)pg/ml，与正常对照组相比，布病患者组TGF-β的水平明显增高(P<0.01)，而治愈组TGF-β的水平较治疗前明显降低(P<0.01)；用CBA法检测出布病患者组、治愈组和正常对照组血清中IL-10的水平分别为(27.18±5.88)pg/ml、(5.48±1.79)pg/ml、(5.10±1.31)pg/ml，与正常对照组相比，布病患者组IL-10的水平明显增高(P<0.01)，而治愈组IL-10的水平较治疗前明显降低(P<0.01)，见图3。

2.4布病患者PD-1的表达与TGF-β 和IL-10的相

表1布病患者的临床特征

Tab.1ClinicalcharacteristicsofpatientswithBrucella

CharacteristicsCategoriesNumber(percentage,%)ofpatients(n=60)ThehistoryofepidemiologyBreedingandcontacthistoryofcattleandsheep57(95%)Eatingundercookedmeatanddairyproducts3(5%)Fever37-37.9℃2(3%)38-38.9℃24(40%)≥39℃34(57%)WeakYes60(100%)HyperhidrosisYes58(97%)No2(3%)ArthrodyniaYes56(93%)No4(7%)GenderMalepatients49(82%)Femalepatients11(18%)Age(years)≥45years34(57%)<45years26(43%)AST1∶1006(10%)1∶20012(20%)1∶40042(70%)

关性 本研究用流式细胞术检测出PD-1在布病患者外周血单核细胞上表达增高，利用CBA法检测出TGF-β 和IL-10在布病患者血清中水平增高。通过Pearson 法分析布病患者体内PD-1与TGF-β 和IL-10的相关性，发现布病患者体内PD-1的表达与TGF-β(r=0.817，P<0.01)和IL-10(r=0.835，P<0.01)的水平均呈明显的正相关，见图4。

图1 布病患者组、治愈组和对照组CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表面PD-1的表达Fig.1 Expression of PD-1 on CD3+T cells,CD4+T cells and CD8+T cells in brucellosis patients group(A),cured group(B) and control group(C)Note: A.The expression of PD-1 on CD3+T cells,CD4+T cells and CD8+T cells of brucellosis patients group;B.The expression of PD-1 on CD3+T cells,CD4+T cells and CD8+T cells of cured group;C.The expression of PD-1 on CD3+T cells,CD4+T cells and CD8+T cells of control group.

表2布病患者组、治愈组和正常对照组急性炎症因子

Tab.2Brucellosispatientsgroup，curedgroupandnormalcontrolgroupofacuteinflammation

GroupsNumber(n)Procalcitonin(ng/ml)IL-6(pg/ml)Hs-CRP(mg/ml)WBC(×109L-1)Neutrophils(%)Brucellosis607.94±1.211)59.11±2.691)31.4±2.681)11.9±1.281)0.83±0.021)Cured340.99±0.012)2.76±0.672)1.06±0.022)5.23±1.352)0.43±0.012)Control600.28±0.122.28±0.430.57±0.014.01±0.850.46±0.02

Note：Compared with control group,brucellosis patients group had the higher acute inflammation expression，1)P<0.01；while in the patients receiving follow-up cured,the acute inflammation expression were remarkably lower than those in pretherapy，2)P<0.01.

表3布病患者组、治愈组和正常对照组PD-1和PD-L1的表达

Tab.3ExpressionofPD-1/PD-L1inbrucellosispatientsgroup,curegroupandcontrolgroup

GroupsNumber(n)PD-1(%)CD3+TcellCD4+TcellCD8+TcellPD-L1(%)DCcellBrucellosis6048.71±6.431)42.72±5.061)77.30±5.891)60.10±7.431)Cured349.97±1.022)4.12±1.032)10.10±1.042)9.83±1.262)Control606.74±1.476.67±1.038.83±1.578.18±1.04

Note：Compared with control group,brucellosis patients group had the higher PD-1/PD-L1 expression，1)P<0.01；while in the patients receiving follow-up cured,the PD-1/PD-L1 expression were remarkably lower than those in pretherapy，2)P<0.01.

图2 布病患者组、治愈组和对照组PD-L1的表达Fig.2 Expression of PD-L1 in brucellosis patients group,cured group and control group

图3 各组血清中TGF-β和IL-10的水平Fig.3 Comparison of serum TGF-β and IL-10 in 3 groupsNote: *.P<0.01，brucellosis group and control group； #.P<0.01,brucellosis group and cured group.

3 讨论

PD-1/PD-L1在宿主体内发挥重要的负性调控作用，主要通过向T细胞内传递抑制信号，阻碍效应T细胞活化和增殖，参与自身免疫病、肿瘤和感染性疾病的发生发展[16-18]。通常PD-1主要表达于活化的T细胞表面，而PD-L1分布较为广泛，在T细胞、B细胞以及抗原提呈细胞等表面均有表达，DC细胞属于专职抗原提呈细胞，能够激活初始和记忆性CD8+T细胞、CD4+T细胞和B细胞，在免疫应答的启动、调控及维稳中发挥重要作用[19]。因此，本研究通过检测布病患者T细胞表面PD-1和DC细胞表面PD-L1，发现布病患者组CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表面PD-1的表达与DC细胞表面PD-L1的表达均高于正常对照组，而治愈组PD-1与PD-L1的表达较治疗前明显降低，推测在布病患者体内PD-1发挥着重要的负性调控作用，抑制T细胞的免疫功能，使布鲁氏菌发生免疫逃逸；当布病患者体内T细胞表面PD-1高达到一定程度时，与DC细胞表面的PD-L1结合，PD-1/PD-L1通路形成，抑制DC细胞的抗原提呈作用，进而使T细胞的功能减弱，分泌的相关细胞因子减少，不利于布鲁氏菌的清除。

图4 PD-1与TGF-β和IL-10的相关性Fig.4 Correlation analysis of PD-1 with TGF-β and IL-10

TGF-β和IL-10是具有免疫抑制作用的主要细胞因子，大多由调节性T细胞(Regulatory cell，Treg)分泌，Treg细胞可分为天然产生的自然调节性T细胞(nTreg)和诱导产生的适应性调节性T细胞(aTreg 或 iTreg)，如Th3、Tr1，其中Tr1细胞分泌IL-10，Th3细胞分泌TGF-β[20]。研究表明，Treg细胞在布鲁氏菌感染中可通过分泌细胞因子TGF-β和IL-10抑制T细胞的免疫应答[21-23]。本研究通过检测布病患者组、治愈组和对照组血清中TGF-β和IL-10的水平发现，布病组TGF-β和IL-10的水平明显高于正常对照组，而治愈组TGF-β和IL-10的水平较治疗前明显降低，推测在布鲁氏菌感染过程中Treg细胞增多，分泌的相应细胞因子功能增强。关于PD-1/PD-L1的研究报道发现，TGF-β可通过激活Smad3信号上调PD-1，进而抑制T细胞的功能[24]。Diana等[25]在研究肿瘤疫苗时发现，IL-10增加可抑制抗原提呈细胞(Antigen presenting cell,APC)的功能，抑制T细胞活化，同时可作用于DC细胞上调PD-L1。本研究通过分析布病患者体内PD-1与TGF-β和IL-10的相关性，发现布病患者体内PD-1的表达与TGF-β和IL-10的水平均呈明显的正相关，推测在布鲁氏菌感染中Treg可能增高，其分泌的相关性细胞因子TGF-β和IL-10也随之增多，TGF-β可能通过激活Smad3信号上调PD-1，IL-10可能通过作用于DC细胞上调PD-L1，有利于PD-1/PD-L1信号通路的形成，传递大量的负性刺激信号，在布鲁氏菌感染中起着重要的负调控作用。

综上所述，在布鲁氏菌感染中，TGF-β和IL-10表达增高使PD-1/PD-L1通路被激活，负调控机体的免疫应答，抑制T细胞的杀菌功能，使布鲁氏菌不能被有效清除，导致机体持续感染。若能研制出下调TGF-β、IL-10、 PD-1和PD-L1的靶向药物，布病将可能会得到很好的控制。

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ExpressionofPD-1andPD-L1inpatientsinfectedwithBrucella

PANGPan,ZHANGFeng-Bo,ZHUYue-Jie,JIABin,ZHANGYue-Xin,ZHANGChun-Tao.REXITI·Fulati,DINGJian-Bing.

CollegeofPreclinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China

Objective:To investigate the roles of PD-1 and PD-L1,as well as related cytokines TGF-β and IL-10 in patients infected with Brucella.MethodsThe expression of PD-1/PD-L1 in peripheral blood mononuclear cell CD3+T cells,CD4+T cells,CD8+T cells,and dendrites cells was detected by flow cytometry in 60 patients infected with Brucella and 34 patients receiving follow-up cured and 60 healthy controls,the serum levels of TGF-β and IL-10 were detected by CBA.The correlations of PD-1 with TGF-β and IL-10 levels in patients infected with Brucella were analyzed by pearson correlation test.ResultsCompared with control,brucellosis patients had the higher PD-1/PD-L1,TGF-β and IL-10 expression (P<0.05),while in the patients receiving follow-up cured,the PD-1/PD-L1,TGF-β and IL-10 were remarkably lower than those in pretherapy (P<0.01),the change of PD-1 was positively correlated with the levels of TGF-β (r=0.817,P<0.01) and IL-10 (r=0.835,P<0.01).ConclusionHigh expression of PD-1/PD-L1 and TGF-β and IL-10 in patients with Brucella may be involved in the negative regulation of Brucella on host immune response.

PD-1;PD-L1;Brucellosis;Cytokine

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.017

R392.11R378.5

A

1000-484X(2017)12-1838-05

①本文为国家自然科学基金项目(81560322)、新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2015211C100)和新疆医科大学科学创新基金(XYDCX201507)。

②新疆医科大学第一附属医院检验科,乌鲁木齐 830011。

③新疆医科大学第一附属医院生殖助孕科,乌鲁木齐 830011。

④新疆医科大学第一附属医院感染科，乌鲁木齐 830011。

庞 盼(1990年-),女,在读硕士,主要从事布鲁氏菌感染方面的研究,E-mail: 2449579487@qq.com。

及指导教师：丁剑冰(1960 年-),女,博士,教授,免疫教研室主任,博士生导师,主要从事感染免疫和生殖免疫方面的研究, E-mail: djbing002@sina.com。

[收稿2017-06-21 修回2017-08-08]

(编辑 倪 鹏)