一贯煎及其加味对辐射损伤小鼠防护作用研究

谢宛君，方 琛，黄伟峰，杜秀婷，肖志勋，朱亚强，钟少文

一贯煎及其加味对辐射损伤小鼠防护作用研究

谢宛君，方 琛，黄伟峰，杜秀婷，肖志勋，朱亚强，钟少文

目的探讨一贯煎及其加味对辐射损伤小鼠的防护作用及其机制。方法以6 MVX直线加速器一次性全身照射小鼠造成辐射损伤，观察一贯煎及其加味对小鼠外周血象、外周血超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性水平及免疫功能(胸腺、脾指数)、骨髓细胞计数、血浆与骨髓环磷酸腺苷水平等指标的变化，推测其对小鼠造血功能、免疫功能的影响及其可能机制。结果成功制备辐射损伤小鼠模型。一贯煎原方及其加味能升高辐射损伤小鼠外周血中白细胞计数、血小板计数、血红蛋白及骨髓细胞计数(P＜0.05)，提高胸腺、脾指数(P＜0.05)，升高骨髓环磷酸腺苷水平和谷胱甘肽过氧化物酶活性(P＜0.05)，各指标在原方组与加味组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论一贯煎原方及其加味对小鼠辐射损伤有较好防护作用，能在一定程度上促进辐射损伤小鼠造血与免疫功能恢复，抗自由基损伤可能是其作用机制之一。

一贯煎；加味；辐射；损伤；防护

随着科学技术的迅猛发展，人类生活与电磁设备关系越来越密切。如今电磁辐射(electromagnetic radiation，EMR)污染是继水污染、大气污染、噪音污染的第四大公害[1]。研究表明，长时间暴露在电磁辐射环境中对作业人员神经、免疫、心血管、消化、血液等多系统均存在不同程度危害[2]，EMR的防护越发受人瞩目。目前，多数抗EMR药物不仅毒性和不良反应较大且价格较昂贵[3]。植物和中草药等天然化合物广泛应用于医学中，具有毒性小、价格低，可以口服给药，并且可以通过调节免疫系统、血液系统等多种机制发挥优势[4]。因此，逐渐成为EMR防护药物开发的研究热点。本研究以滋阴疏肝治法为切入点，观察一贯煎及其加味对辐射损伤小鼠的防护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体级昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重18～22 g，购自广州中医药大学大学城校区实验动物中心[SCXK-(粤)-2013-0020]，实验动物合格证号44005900001579。

1.1.2 药剂与仪器 一贯煎原方、加味一贯煎、补中益气汤全方饮片经广州中医药大学中药学院方剂学教研室鉴定后，分别水煎、浓缩，分装冷藏备用。外周血超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)试剂盒、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)试剂盒、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)、3%醋酸液、水合氯醛等(深圳市恩缇生物科技有限公司)。辐射源Varian 2300C/D直线加速器(美国瓦里安公司，广东省中医院大学城医院放射科提供)，高速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)，FA2004N电子天平(上海精密仪器仪表有限公司)，超低温冰柜，玻璃毛细吸管，F-820型血细胞计数仪(日本东亚公司)，双目光学显微镜(日本OLYMPUS)，FJ-2107液体闪烁测量仪(西安二六二厂)等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和造模 将小鼠随机分为正常组、模型组、益气组、原方组、加味组5组，每组10只。益气组、原方组、加味组分别灌胃相应药液，给药剂量为0.4 g/mL(成人临床等效剂量)；正常组和模型组按相同容量灌胃给予蒸馏水；每天灌胃1次，持续40 d。灌胃第30天，除正常组外，其余各组小鼠置于大小20 cm×20 cm、内置隔板、分为16个大小5 cm×5 cm的空间中，每个空间放置1只小鼠以避免照射时产生重叠。使用Varian 2300C/D直线加速器产生的6 MV X线建立EMR损伤模型；照射距离1 m，照射面积25 cm×25 cm，照射剂量6 Gy，时间3 min，剂量率2 Gy/min，一次性全身照射。

1.2.2 外周血常规检测 分别于照射后3、10 d对小鼠断尾取血约20 μL，稀释，推片，使用血细胞计数仪检测外周血常规白细胞(white blood cell，WBC)计数、红细胞(red blood cell，RBC)计数、血小板(platelet，PLT)计数和血红蛋白(hemoglobin，Hb)水平，并计算网织红细胞(reticulocyte，Ret)。

1.2.3 骨髓细胞计数 分2批次腹腔注射水合氯醛处死小鼠，剥离小鼠右侧完整股骨，以PBS 10 mL从一侧关节冲出骨髓内细胞，血细胞计数仪自动计算右侧股骨骨髓细胞(bone marrow cell，BMC)计数。

1.2.4 脾脏、胸腺称重和外周血SOD、GPX活性水平检测 小鼠称重，记录数据后水合氯醛处死，剖开胸腹部，取出脾脏和胸腺，称重并记录，计算胸腺、脾脏指数，胸腺(脾脏)指数(%)＝胸腺(脾脏)重量(g)/小鼠体重(g)×100%。摘除小鼠眼球，毛细玻璃管取血，按照试剂盒说明书检测酶活性水平。

1.2.5 血浆和骨髓cAMP检测 取小鼠血100 μL，以0.5 mol/L四乙酸二氨基乙烷15 μL抗凝，2 000 r/min离心10 min，分离出的血浆按cAMP试剂盒说明测定外周血cAMP水平。同时取小鼠左侧股骨，以6号针头冲出骨髓，先进行BMC计数，再按试剂盒说明测定骨髓中cAMP水平。

1.3 统计学处理 应用SPSS 19.0软件，计量资料以均数±标准差(¯x±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血常规及Ret 照射后各组小鼠WBC计数大幅降低，照射后3 d原方组WBC计数高于模型组(t＝3.05、P＝0.037)；照射后10 d各组小鼠WBC计数不同程度升高，加味组、益气组WBC计数高于模型组(t分别为7.11、1.59，P分别为0.004、0.032)。照射后各时段，模型组Hb低于正常组(照射后3、10 d，t分别为2.85、2.36，P分别为0.041、0.028)，照射后3 d益气组与模型组比较差异有统计学意义(t＝1.50、P＝0.011)，照射后10 d原方组、加味组Hb高于模型组(t分别为2.61、1.16，P分别为0.013、0.048)。照射后模型组与正常组比较PLT计数下降明显(照射后3、10 d，t分别为4.68、2.36，P分别为0.009、0.028)，益气组PLT计数在2个时段均高于模型组(照射后3、10 d，t分别为3.07、4.85，P分别为0.029、0.038)，照射后3 d加味组和照射后10 d原方组PLT计数高于模型组(t分别为2.61、1.16，P分别为0.017、0.021)。照射后各组Ret先下降后逐渐上升。照射后模型组Ret明显低于正常组(照射后3、10 d，t分别为6.39、4.98，P分别为0.003、0.008)，益气组小鼠Ret在照后2个时段均高于模型组(照射后3、10 d t分别为3.52、2.19，P分别为0.007、0.046)。见表1。

表1 各组10只小鼠外周血常规及Ret(¯x±s)

2.2 股骨BMC计数 照射后模型组小鼠BMC计数较正常组下降明显(t＝9.36、P＝0.001)，益气组、原方组小鼠BMC计数与模型组比较差异均有统计学意义(t分别为3.16、4.24，P分别为0.046、0.003)。见表2。

2.3 免疫功能及SOD、GPX活力水平 照射后各组小鼠胸腺、脾指数均降低，2个指标在原方组和益气组小鼠中高于模型组(胸腺指数，t分别为3.28、2.13，P分别为0.048、0.029；脾脏指数，t分别为2.94、2.70，P分别为0.033、0.045)，加味组脾指数高于模型组(t＝6.51、P＝0.028)。照射后各组小鼠SOD活性均降低，其中正常组与模型组比较差异有统计学意义(t＝4.28、P＝0.038)。模型组GPX活性低于正常组(t＝7.12、P＝0.024)，原方组、加味组高于模型组(t分别为5.29、4.85，P分别为0.019、0.042)。见表2。

2.4 外周血、骨髓cAMP水平 照射后模型组与正常组比较cAMP水平降低明显(t分别为3.24、4.01，P分别为0.036、0.029)，加味组外周血cAMP与模型组比较差异有统计学意义(t＝0.82、P＝0.044)。3个给药组骨髓cAMP水平显著高于模型组(t分别为1.47、1.53、0.30，P分别为0.004、0.001、0.007)。见表2。

表2 各组10只小鼠股骨BMC计数、胸腺与脾脏指数、SOD与GPX活性、外周血与骨髓cAMP水平(¯x±s)

3 讨论

热效应、非热效应与累积效应是目前公认的EMR危害健康的3种生物学效应[5]。热效应损伤即机体受照射后，内部水分子相互快速摩擦产热，使体温升高，改变人体细胞生存的内外环境，进一步影响细胞结构及细胞分裂增殖过程，引起病理反应。非热效应认为外界电磁场干扰了人体内部正常“自身磁场”，从而在细胞和分子水平上影响其生物物理和生物化学反应的过程[6]。累积效应即反复多次经受上述2种效应，损伤累积到一定程度后，机体正常生理机制出现不可逆的损伤。中医认为高能射线是一种火邪、热毒[7]。《素问·阴阳应象大论》云“壮火之气衰……壮火食气……壮火散气”，射线热毒充斥体内，耗伤人体气阴津液，伤及肝肾之阴，易致生风动血，临床表现主要包括口干舌燥、渴欲饮水、目赤咽肿、小便短赤、皮肤发斑、衄血甚至烦躁不宁、谵妄发狂、昏迷等神志症状；热盛肉腐，易致疮疡，因此也可导致肿瘤占位等病变。治疗上，当以“壮水之主，以制阳光”为基本治则，滋阴为重。中药方剂一贯煎由沙参、麦冬、生地黄、当归、枸杞子几味药组成，旨在滋阴养血、疏肝清热。本课题研究一贯煎及其加味(原方基础上加柴胡、黄芩)对EMR损伤小鼠的防护作用，各项检测结果显示照射后小鼠外周血WBC计数、Hb、PLT计数、Ret均比正常组低，BMC损伤较重，血中SOD与GPX活性水平、外周血与骨髓中cAMP水平均降低，同时胸腺、脾指数下降，与高明泽等[8]研究一致，证明成功建立EMR损伤小鼠模型。

造血系统对辐射高度敏感[9]，造血功能损害是贯穿病程始终的基本损伤[10]，外周血RBC计数、WBC计数、Hb和PLT计数能够客观地反映造血系统的损伤程度[11]。照射后模型组小鼠BMC计数下降明显，益气组、原方组小鼠BMC计数与模型组比较有显著性差异，反映照射后小鼠骨髓抑制严重，而2个方能较好地缓解骨髓抑制程度、保护和促进BMC增生。造血器官的EMR损伤首先体现在外周血WBC计数上，是反映辐射损伤最直接、最经典的指标[12]。照射后各组小鼠WBC计数大幅降低，照射后3 d原方组小鼠WBC计数高于模型组，照射后10 d各组小鼠WBC计数较前升高，加味组、益气组小鼠WBC计数高于模型组，说明一贯煎及其加味对辐射所致WBC损伤有较好的防护作用。照射使Ret分裂增殖功能受阻，照射后模型组Ret明显低于正常组，照射后2个时段原方组、加味组与模型组相比差异不明显，提示对小鼠Ret作用不明显。成熟RBC由Ret发育而成，但成熟RBC寿命约120 d，更新慢，加上对射线敏感性较WBC低，故照射后3、10 d 4组小鼠RBC变化均不明显。照射后2个时段模型组Hb均低于正常组，照射后3 d益气组及照射后10 d原方组、加味组Hb高于模型组，提示3个方均具有促进Hb生成的潜力。成熟巨核细胞在损伤初期仍然残留生成PLT的能力，而PLT寿命为9～10 d，随着受损的巨核细胞功能逐渐丧失，数量减少，PLT生成受阻[13]，故照射后10 d小鼠PLT计数下降程度明显比照射后3 d严重。照射后模型组PLT计数下降明显，益气组在2个时段、照射后3 d加味组、照射后10 d原方组小鼠PLT计数高于模型组，提示3个方可一定程度上减缓外周血中PLT计数下降速度。

免疫系统损伤是EMR损伤的另一个重要表现[14]。胸腺、脾脏指数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱，照射后各组小鼠胸腺、脾指数均降低，2个指标在原方组和益气组小鼠中均高于模型组，加味组脾指数高于模型组，说明3个方可不同程度增强照射后胸腺、脾脏组织修复能力，改善机体免疫功能。

EMR可以直接与水作用，使水分子辐射分解产生大量自由基，破坏机体氧化还原平衡状态，导致机体抗氧化能力下降[15]。SOD、GPX是抗自由基损伤的重要物质，可用来作为抗EMR损伤的一个客观生化指标。本研究显示，补中益气汤、一贯煎及其加味对EMR损伤小鼠SOD活性水平修复作用不明显；原方组、加味组GPX活性高于模型组，反映一贯煎原方及其加味对EMR所致自由基损伤有一定保护作用。cAMP作为信号转导最普遍的第二信使，参与体内多种造血调控因子对造血细胞增殖、分化和凋亡的调节[16]，机体免疫反应以及细胞增殖和分化均与cAMP有关[17]。因此，cAMP水平间接影响造血、免疫功能。照射后小鼠cAMP水平降低明显，益气组、原方组、加味组骨髓cAMP水平均显著高于模型组，提示3个方可有效升高骨髓中cAMP水平，通过促进受损细胞代谢，激活BMC增殖分化，修复造血功能及受损组织、脏器。

本实验成功制备了EMR损伤小鼠模型，各项指标检测结果显示一贯煎原方及其加味可有效修复小鼠部分造血功能，特别是对外周血WBC计数、Hb、PLT计数和BMC计数4个指标，同时能在一定程度上修复EMR损伤小鼠免疫功能，提高其胸腺、脾指数，升高骨髓中cAMP水平，上述指标与益气组效果相差不大；2个方对提高EMR损伤小鼠SOD活性作用不明显，但对GPX活性效果明显，在抗自由基损伤方面优于补中益气汤，考虑为其EMR防护作用的可能机制之一。上述各项指标在原方组与加味组之间比较差异均不明显。

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Protective effect of Yiguanjian and its additives against radiation injury in mice

XIE Wanjun1，FANG Chen2，HUANG Weifeng1，DU Xiuting1，XIAO Zhixun1，ZHU Yaqiang1，ZHONG Shaowen2
(1.The Second Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou Guangdong 510405，China；2.Department of Breast Disease，Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine，Guangzhou Guangdong 510120，China)

ObjectiveTo discuss the protective effect and mechanisms of Yiguanjian and its additives on mice with radiation injury.MethodsExpose the mice to total body irradiation by 6 MV X linear accelerator to cause radiation injury，to observe the changes of Yiguanjian and its additives on indexes such as peripheral hemogram，superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GPX)activity levels，immune functions(thymus coefficient and spleen coefficient)，bone marrow cells(BMC)，cyclic adenosine monophosphate(cAMP)levels in plasma and bone marrow，and infer their influence on hematopoietic function，immune function and the possible mechanisms.ResultsWe built up the radiation injury mouse model successfully.Yiguanjian and its additives could increase white blood cells(WBC)，hemoglobin(Hb)，platelet(PLT)of peripheral blood and BMC(P＜0.05)，rise the thymus coefficient and spleen coefficient(P＜0.05)，together with cAMP levels in bone marrow and GPX activity levels(P＜0.05).The difference of the related indexes between the Yiguanjian group and the additive group was not obvious(P＞0.05).ConclusionYiguanjian and its additives have preferable protective effects on irradiated mice，they can promote the recovery of hematopoietic function and immune function of mice with radiation injury to a certain extent，anti-free radical injury may be one of the possible mechanisms.

Yiguanjian；Additives；Radiation；Injury；Protection

R286.96－332

A

2095-3097(2017)06-0345-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.06.007

广东省大学生创新创业训练计划项目立项资助(1057213041)

510405广东广州，广州中医药大学第二临床医学院(谢宛君，黄伟峰，杜秀婷，肖志勋，朱亚强)；510120广东广州，广东省中医院乳腺科(方 琛，钟少文)

钟少文，E-mail:1330366581＠qq.com

2017-05-25 本文编辑:徐海琴)