响应面法优化洋金花中东莨菪碱的提取

黄惠明， 李珊珊， 杨 敏， 林霜霜， 吴维坚， 林洪涛， 林振宇， 邱 彬， 郑开斌

(1. 福建省农业科学院亚热带农业研究所， 福建 漳州 363000； 2. 福州大学化学学院， 福建 福州 350116)

响应面法优化洋金花中东莨菪碱的提取

黄惠明1， 李珊珊1， 杨 敏1， 林霜霜1， 吴维坚1， 林洪涛1， 林振宇2， 邱 彬2， 郑开斌1

(1. 福建省农业科学院亚热带农业研究所， 福建 漳州 363000； 2. 福州大学化学学院， 福建 福州 350116)

运用响应面法进行实验设计， 对洋金花中东莨菪碱在超声提取过程中的各因素进行考察优化. 采用HPLC法测定东莨菪碱的质量浓度， 以盐酸浓度、 提取时间、 液料比为考察因素， 东莨菪碱提取率为响应值， 用Box-Behnken响应面法设计提取工艺实验， 建立预测方程， 优化提取工艺. 结合实际可操作性， 确定最佳提取条件为： 盐酸浓度3 mol·L-1， 提取时间43 min， 液料比25 mL·g-1. 实验结果显示， 实际值与预测值的偏差为2.76%， 相关性良好， 说明对洋金花中东莨菪碱的提取进行响应面法优化合理可行.

响应面法； 洋金花； 东莨菪碱； 提取

0 引言

白花曼陀罗(DaturametelL.)， 又名洋金花、 大喇叭花、 山茄子等. 春季花开后， 采其鲜花， 晒干或低温干燥， 即为中药“洋金花”, 此品辛、 温、 有毒， 可作为麻醉剂[1-3]. 洋金花的化学成分主要有东莨菪碱、 莨菪碱等莨菪烷型生物碱， 是其对神经系统相关疾病起作用的化学基础[4-5]. 响应面法(response surface methodology， RSM)是一种条件寻优的实验方法[6-7]， 通过进行一系列设定好的实验(实验前需合理选取不同因素水平的条件)获得实验数据， 拟合出方程， 最后将函数以图形的方式表现出来直观地选择实验的最优参数. 实验参考2015版《中国药典》[8]， 采用超声法提取洋金花中东莨菪碱， 以高效液相色谱法(HPLC)检测其含量[9-10]. 运用响应面法(Box-Behnken设计)进行实验设计， 对提取过程中的各因素进行考察研究.

1 实验材料

洋金花购自漳州市腾信化玻仪器有限公司， 经福建省农业科学院吴水金老师鉴定, 为白花曼陀罗的干燥花； 乙腈(色谱纯，φ≥99.9%)； 磷酸钠(分析纯，w≥98%)； 十二烷基硫酸钠(分析纯，w≥99%)； 三氯甲烷(分析纯，φ≥99%)； 磷酸(分析纯，φ≥85%)； 浓氨水(分析纯，φ=25%～28%)； 东莨菪碱氢溴酸盐(C12H21NO4·HBr3H2O，w≥98%).

高效液相色谱仪(型号Thermo Ultimate-3000， 美国赛默飞世尔公司)； 液相自动进样器(型号Alias， 荷兰Spark公司)； 超声提取器(型号KQ-300DE， 昆山市超声仪器有限公司)； 旋转蒸发仪(型号RE-52AA， 上海亚荣生化仪器厂)； 酸度计(型号Thermo orion model 818， 美国赛默飞世尔公司)； 分析天平(Sartorius BSA系列， 德国赛多利斯公司).

实验设计软件为Design-Expert 8.0.5b.

2 标准曲线绘制

2.1 试剂制备

磷酸钠溶液： 精密称取磷酸钠27.15 g， 十二烷基硫酸钠5.107 g， 溶于水， 磷酸调节pH值至6.0， 定容于1 L容量瓶中， 配制成0.07 mol·L-1磷酸钠溶液(含0.017 5 mol·L-1十二烷基硫酸钠).

氢溴酸东莨菪碱标准液： 精密称取东莨菪碱氢溴酸盐0.101 4 g， 加蒸馏水溶解并定容于100 mL容量瓶中， 制成标准液(东莨菪碱氢溴酸盐质量浓度为0.993 3 mg·mL-1).

流动相： 乙腈-0.07 mol·L-1磷酸钠溶液(体积比1∶2).

色谱条件： C18色谱柱(Thermo Fisher， 5 μm， 4.6 mm×250 mm)； 以乙腈-0.07 mol·L-1磷酸钠溶液为流动相； 进样量20 μL， 柱温25 ℃， 检测波长216 nm； 理论板数以氢溴酸东莨菪碱峰计算应大于3 000. 标准品及样品色谱图见图1, 其中，m东莨菪碱=m氢溴酸东莨菪碱/1.445.

图1 氢溴酸东莨菪碱标准品及样品的HPLC图Fig.1 Reference substance and sample chromatograms of scopolamine hydrobromide

2.2 标准曲线

取适量标准液分别配制质量浓度为0.2， 0.4， 0.5， 0.6， 0.9， 1.0 mg·mL-1的氢溴酸东莨菪碱， 进样， 测定峰面积， 以标准品质量浓度(ρ)为横坐标， 峰面积(Y)为纵坐标， 绘制标准曲线， 得回归方程为Y=187.2ρ-0.047 5(r=0.999 9). 实验结果表明， 氢溴酸东莨菪碱质量浓度在0.20～0.99 mg·mL-1范围内与其峰面积呈良好的线性关系.

2.3 精密度及重复性实验

在上述色谱条件下， 取氢溴酸东莨菪碱质量浓度为0.4 mg·mL-1的标准品溶液， 重复进样5次， 测得峰面积的RSD为1.7%.

精密称取供试样品约1 g， 共5份， 按以上方法处理、 测定， 得东莨菪碱的平均提取率为0.33%， RSD为1.8%.

2.4 加标回收率

准确移取已知质量浓度的样品提取液3份， 分别加入与样品中东莨菪碱质量浓度相当的标准品， 测定其加标回收率， 结果见表1.

表1 氢溴酸东莨菪碱加标回收率Tab.1 Recoveries of scopolamine hydrobromide

3 东莨菪碱提取率的测定

精密称取洋金花粉末约1 g(过300 μm筛)， 置锥形瓶中， 加入盐酸溶液， 超声处理(270 W， 频率40 kHz)， 放冷， 过滤， 用相同浓度盐酸溶液10 mL分数次洗涤滤渣和滤器， 合并滤液和洗液， 用浓氨水调节pH值至9.0， 用三氯甲烷振摇提取4次， 每次10 mL， 合并提取液， 回收溶剂至干， 残渣用流动相溶解， 转移至10 mL量瓶中， 定容. 样品使用前均经0.45 μm微孔滤膜过滤. 精密吸取样品溶液20 μL， 注入液相色谱仪， 测定.

4 Box-Behnken 响应面法

4.1 实验设计

参考2015版《中国药典》， 在前期预试验的基础上， 采用响应面法(Box-Behnken设计)进行实验设计， 对盐酸浓度(A)、 提取时间(B)、 液料比(C)进行考察， 设计3因素3水平响应面， 共选取19个试验点， 因素水平、 实验设计及结果见表2、 3.

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels of the method

表3 Box-Behnken实验设计及结果Tab.3 Design and results of Box-Behnken experiment

续表3

StdRunA cHCl/mol·L-1 B t/min C 液料比/mL·g-1 D m洋金花/g R 提取率/% 181(-1)10(-1)15(0)0．99970．1422791(-1)30(0)25(1)0．99930．179419102(0)30(0)15(0)1．00400．31333111(-1)50(1)15(0)1．00100．24479122(0)10(-1)5(-1)0．99950．15145131(-1)30(0)5(-1)1．00100．156611142(0)10(-1)25(1)1．00000．16212153(1)10(-1)15(0)0．99960．268613162(0)30(0)15(0)1．00300．32906173(1)30(0)5(-1)1．00300．250917181(-1)30(0)30(1．5)∗1．00600．195218192(0)15(-0．75)∗15(0)1．00000．2157

注：括号中数据为因素水平值，其中加*数据为软件设计外的实验取点

4.2 结果与分析

将上述结果数据利用Design-Expert 8.0.5b软件对A、B和C进行多元线性回归及二项式拟合， 得方程：R=-0.184 7+0.161 3A+1.011×10-2B+8.503×10-3C-6.988×10-4AB+1.180×10-3AC+1.773×10-4BC-2.722×10-2A2-1.450×10-4B2-4.384×10-4C2，r2=0.941 1. 响应面二次回归方程方差分析结果见表4.

由表4可知， 依据F值的大小， 各因素对提取率影响程度依次为A>B>C. 同时A、B、C、B2、C2各项都达到了极显著水平(P<0.01)，BC项达显著水平(P<0.05). 表明3个因素对东莨菪碱的提取均有极显著的影响， 其中液料比和提取时间交互作用也会对东莨菪碱的提取率带有显著影响.

表4 方差分析Tab.4 Variance analysis of the method

注：P<0.05为显著水平，P<0.01为极显著水平

运用软件将各因素对东莨菪碱的提取影响绘制成响应面及等高线图(见图2)， 了解各因素的交互作用对提取率的影响. 图2(a)显示， 提取率随盐酸浓度(A)的增加先迅速升高后增幅缓慢， 随提取时间(B)的增加先升高后缓慢降低. 图2(b)显示， 提取率随盐酸浓度(A)的增加先迅速升高后缓慢降低， 随液料比(C)的增加先升后降. 图2(c)显示， 提取率随提取时间(B)的增加先升后降， 随液料比(C)的增加先升后降.

4.3 优化工艺和验证试验

通过Design-Expert 8.0.5b软件， 对模型进行预测分析， 得到洋金花中东莨菪碱的最优提取工艺为： 盐酸浓度3 mol·L-1、 提取时间42.56 min、 液料比24.46 mL·g-1、 提取率为0.394 6%. 考虑到实际操作的可行性， 最终确定为盐酸浓度3 mol·L-1， 提取时间43 min， 液料比25 mL·g-1， 根据优化工艺参数进行验证试验， 平行3次， 平均提取率为0.383 7%， 实际值与预测值的偏差为2.76%， 表明其相关性良好， 说明对洋金花中东莨菪碱的提取进行响应面法优化合理可行.

[1] 李花． 洋金花的药理作用及临床应用[J]． 现代医药卫生, 2012， 28(19)： 3 001-3 002．

[2] 张广衡， 张忠富， 王基业． 中药麻醉在脊柱手术的应用(附45例报告)[J]． 人民军医， 1977, 20(11)： 38-40．

[3] 王树荣， 肖林添， 张白玲， 等． 中药麻醉用于战伤手术87例[J]． 人民军医， 1980, 23(9)： 15-17．

[4] 杨炳友， 夏永刚， 陈东， 等． 洋金花的化学成分[J]． 中国天然药物， 2010， 8(6)： 429-432.

[5] 何丽娅， 玉梅娟， 李映红， 等． 洋金花总生物碱抗氧化作用的实验研究[J]． 中药药理与临床, 1994, 10(3)： 32-49．

[6] BOX G E P, WILSON K B. On the experimental attainment of optimum conditions[J]. Journal of the Royal Statistical Society, 1951, 13(1)： 1-45.

[7] 李化， 柯华香， 李发洁， 等． Box-Behnken响应面法优选五味子多糖双水相提取工艺[J]． 中药材, 2016， 39(3)： 593-597．

[8] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 一部[S]. 北京: 中国医药科技出版社， 2015．

[9] 张俐， 王玉． 洋金花药材HPLC指纹图谱分析[J]． 中国中医药信息杂志， 2008， 15(12)： 53-54．

[10] PRAMOD K K, SINGH S, JAYABASKARAN C. Biochemical and structural characterization of recombinant hyoscyamine 6β-hydroxylase fromDaturametelL.[J]. Plant Physiology & Biochemistry, 2010, 48(12)： 966-970.

OptimizationontheextractionofscopolaminefromtheflowerofDaturametelL.byresponsesurfacemethodology

HUANG Huiming1, LI Shanshan1, YANG Min1, LIN Shuangshuang1, WU Weijian1, LIN Hongtao1,LIN Zhenyu2, QIU Bin2, ZHENG Kaibin1

(1. Subtropical Agricultural Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Zhangzhou, Fujian 363000, China;2. College of Chemistry, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116, China)

In this study, the extraction method of scopolamine fromDaturametelL. was the ultrasonic extraction, while its mass concentration was detected by HPLC. Factors in the extraction process were investigated in a series of experiments designed by response surface methodology. Combined with the actual situation and the operable principles, the optimized conditions were as follows: the concentration of hydrochloric acid was 3 mol·L-1, extraction time was 43 min, and the ratio of liquid to solid was 25 mL·g-1. The results displayed that the difference between the real value and the predicted value was 2.76%, showed good correlation, which indicating that the optimization on the extraction of scopolamine from the flower ofDaturametelL. by response surface methodology was reasonable and practicable.

response surface methodology;DaturametelL.; scopolamine； extract

10.7631/issn.1000-2243.2017.05.0770

1000-2243(2017)05-0770-05

O652.1

A

2017-06-08

郑开斌(1966-)， 博士， 研究员， 主要从事作物品质育种及芳香药用植物天然产物方面的研究， 409119296@qq.com

福建省省属公益类科研院所基本科研专项资助项目(2015R1013-4)； 福建省农业科学院青年人才创新基金资助项目(YC2017-2)

(责任编辑： 洪江星)