原发性卵巢功能不全小鼠卵巢血流与性激素浓度相关性研究

冯逊逊 董晓英 郑秀蕊

(1.首都医科大学基础医学院，北京 100069;2.首都医科大学中医药学院，北京 100069)

·基础研究·

原发性卵巢功能不全小鼠卵巢血流与性激素浓度相关性研究

冯逊逊1董晓英2*郑秀蕊1

(1.首都医科大学基础医学院，北京 100069;2.首都医科大学中医药学院，北京 100069)

目的研究原发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)小鼠卵巢的血流动力学与性激素浓度的相关性。方法以小鼠透明带3作为抗原，皮下多点注射，免疫BALB/C雌性小鼠建立原发性卵巢功能不全模型，利用超声动态观察卵巢的形态，同时利用超声彩色多普勒成像观察卵巢的血流变化，最后取小鼠血清进行性激素浓度检测。结果超声下可观察到模型组小鼠卵巢体积减小，卵泡数目减少，血流分布较弱。与空白组小鼠相比较，模型组小鼠阻力指数 (resistive index，RI)较高，搏动指数(pulsatility index，PI，PI=S-D/Vmean)较低，脉压差(pulse pressure，PP)呈升高趋势；与空白组小鼠相比较，模型组小鼠的促卵泡生长激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)均差异有统计学意义(P<0.05)。进一步通过模型组小鼠血流动力学与激素浓度相关性检验，发现模型组小鼠PP与FSH有一定(P<0.05)。结论POI小鼠血流动力学PP与血清学FSH浓度有显著相关性，本研究为动态观察POI治疗过程提供参考。

原发性卵巢功能不全；超声血流；动态；性激素；相关性

原发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是指卵巢不全所导致的40岁之前或者更早即出现高促性腺激素性闭经的现象[1]。特点是原发或继发闭经伴随血促性腺激素浓度升高和雌激素浓度降低[2]，包含卵巢内卵泡功能障碍或原始卵泡耗竭两个过程。近年来POI发病率有所增高[3]，引起了广泛关注。超声动态监测卵巢变化及卵泡发育在POI临床治疗中扮演着重要的角色。相关研究[4]显示，卵泡发育与激素浓度具有相关性，临床通常应用超声检测卵泡发育并对POI的治疗效果进行评价。随着小动物超声系统在基础研究中的广泛开展，源于临床的超声方法可用于基础研究，从而进一步探究疾病发生机制，为发现临床中问题的特点奠定基础。本研究是将正常小鼠转变为免疫性原发性卵巢功能不全的模型，通过超声动态观察模型组与空白组小鼠的卵巢形态及血流动力学指标，检测血清学激素浓度并对两者进行相关性研究，为后续的实验提供一个新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级BABL/c雌性小鼠20只，7～8 周龄，体质量18～22 g，由北京维通利华实验动物中心提供，实验动物合格证号: SCXK(京)2012-0001。

1.2 试剂

小鼠透明带多肽溶液：根据小鼠透明带3(zone pellucida 3，ZP3)的第330～342个氨基酸序列 (NSSSSQFQIHGPR)，合成透明带多肽，其分析纯度>90%，杭州多肽生化有限公司生产；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，美国Sigma公司产品。

1.3 实验仪器

应用超高分辨率小动物彩色多普勒超声成像系统(Vevo 2100 Imaging System,Fujifilm Visual Sonics Inc,美国)，MS-550D(700D)高频宽带电子线阵探头。探头中心频率40 MHz，最高分辨率40 μm；轴向分辨力和横向分辨力分别为40 μm和90 μm；采集深度11 mm，增益25 dB。

1.4 免疫性POI小鼠模型建立

雌性小鼠均经阴道脱落细胞涂片筛查，性周期正常。将20只小鼠数字表法随机分组，10只做为空白组，其余10只用于造模。称取 6 mg ZP3 透明带多肽粉末，加入 6 mL 双蒸水配成溶液，与弗氏完全佐剂按1∶1比例配制成免疫试剂，与弗氏不完全佐剂按1∶1比例制成免疫强化试剂。参考文献[5]每鼠予0.15 mL 免疫试剂多点注射到腹腔皮下，14 d后以免疫强化试剂0.15 mL再次多点注射到小鼠腹腔皮下加强免疫。空白组每次造模时每只小鼠予以0.15 mL 0.9%(质量分数)氯化钠注射液注射到腹腔皮下。注射完成后，造模1周后使用瑞士染色法进行阴道涂片观察。每周需观察小鼠腹部的肿胀情况，以判断造模试剂的吸收情况。

1.5 高频率小动物超声系统动态观察

1)动物麻醉及准备：操作前使用脱毛膏(NAIR，加拿大)脱去小鼠腰背部探头扫描区域的被毛，将小鼠放入麻醉诱导箱，调节氧气至1 L/min，调节异氟烷至2.5%。麻醉后将小鼠取出，俯卧绑定于小鼠专用操作台，四肢连接电极，固定并维持超声平台温度40 ℃，用麻醉面罩罩住小鼠的口鼻部，并调节异氟烷的维持量为1.0%～1.5%持续予吸入。在小鼠被毛区涂适量超声耦合剂，避免对检查部位施加压力。

2)超声探头定位及二维超声成像：探头首先置于小鼠右侧背外侧上方2～3 mm处，探头切迹朝向小鼠头侧，调节专用操作台的微调旋钮，使平台从头部向尾部移动，直至右侧卵巢可见，并使肾脏作为标志位于卵巢的头侧。通过调节最佳增益和增益补偿设置获得满意的卵巢纵轴切面二维超声图像。转动微调旋钮，保存整个右侧卵巢的图像动态视频(300帧/10 s图像动态视频)。将探头旋转90°，获得卵巢横轴切面二维超声图像并保存，使用同样的方法保存左侧卵巢的图像动态视频。

3)超声采集卵巢血流图像：将彩色取样框置于卵巢上，调节入射角，显示卵巢间质动脉，观察卵巢基质内的动脉血流，用脉冲多普勒显示其频谱，得到满意频谱后连续记录3～5个心动周期，记录卵巢间质动脉峰值流速(peak systolic velocity，PSV) 和阻力指数(resistive index，RI) 并保存图像。

1.6 取血

6周后采用心脏穿刺取血，处死动物，将小鼠血液标本静置，3 000 r/min离心，用移液器取血清。

1.7 高频小动物超声系统动态观察

1)卵巢面积及卵泡数目：在超声影像工作站对所获卵巢图像进行离线测量分析。二维图像：于长轴切面测量卵巢的纵径和前后径，短轴切面测量卵巢的横径和前后径；根据假设卵巢为椭圆体并按照椭圆体公式计算卵巢面积：卵巢面积(cm2)=纵径×横径；控制所获取的左右卵巢的图像动态视频一帧一帧回放，保存每一帧图像并计数卵泡个数及测量卵泡直径。根据每一次采集卵巢连续切面图像中卵泡个数，计算最大切面下最大窦卵泡数。

2)观察卵巢血流和血阻的测量：在超声影像工作站中采集小鼠卵巢血流图像，停帧测量收缩期最大血流速度(Vmax)、舒张期最低血流速度(Vmin),仪器自动求出脉压差(pulse pressure，PP,即平均收缩压减平均舒张压)、阻力指数(RI=S-D/S)及搏动指数(pulsatility index，PI，PI=S-D/Vmean)。

1.8 放射免疫法检测

采用放免试剂盒，按照试剂盒说明书操作要求测定小鼠血清雌激素(estrogen，E2)、促卵泡生长激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormone，H)、黄体酮(progesterone，P)和抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)激素浓度。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠阴道涂片观察

观察空白组和模型组小鼠的阴道涂片，可观察到空白组小鼠动情周期正常，模型组小鼠动情周期发生紊乱。肉眼观察可见空白组小鼠阴道分泌物黏稠呈拉丝状，模型组小鼠阴道分泌物较为稀薄。镜下可见，空白组小鼠动情期细胞较为均质，角化上皮细胞呈落叶状堆积；模型组小鼠动情周期紊乱，动情期细胞不均质，有多种细胞混杂，如角化上皮细胞，白细胞和淋巴细胞等(图1)。

2.2 超声动态观察

2.2.1 小鼠卵巢形态观察

在每周的动态观察中，发现空白组小鼠卵巢面积变化不大，卵泡较为均匀分布在皮质周围。模型组小鼠的卵巢体积自第2周起逐渐变小，由于伴随着卵泡数量的减少，卵泡的分布也较为稀少(图2)。

2.2.2 超声多普勒观察小鼠卵巢血流

在连续每周的动态观察中，发现空白组小鼠卵巢血流变化不大，空白组小鼠血流丰富，由第2周到第6周基本维持在同一水平。模型组小鼠由第2周到第6周血流持续减少(图3)。

图1 阴道涂片Fig.1 Smears of vaginal

图2 卵巢形态Fig.2 Morphology of ovary

A：Ovarian morphology of blank group mice in the first week and the ovarian follicle around the cortex was represented by the arrow；B：ovarian morphology of blank group mice in the sixth week；C：ovarian morphology of model group mice in the first week；D：ovarian morphology of blank group mice in the sixth week.

图3 多普勒血流Fig.1 Doppler blood flow

A：blood distribution of blank group mice in the first week；B：blood distribution of blank group mice in the sixth week；C：blood distribution of model group mice in the first week；D：blood distribution of model group mice in the sixth week.

2.2.3 超声血流数据动态变化图

在连续每周的动态观察中，可测得空白组和模型组小鼠的脉压差、阻力指数和搏动指数的数值，每组取均值后，按照周为横坐标，数值为纵坐标得到血流动力学数据的动态图。由动态图观察到，空白组脉压差维持在低水平的动态平衡，模型组脉压差呈高水平上升趋势；空白组的RI基本保持在稳定的波动范围内，模型组RI值高于空白组；空白组PI维持在较高水平的动态平衡，模型组的PI呈下降趋势(图4)。

*PP A is the PP of model group and PP B is the PP of blank group.RI A is the RI of model group and RI B is the RI of blank group.PI A is the PI of model group and PI B is the PI of blank group;SBP:systolic blood pressure;DBP:diastolic blood pressure;RI:resistive index;PP:pulse pressure;PI:pulsatility index；△1 mmHg=0.133 kPa.

2.3 血清学激素浓度

2.3.1 血清学检测数据统计

通过ANOVA 方法分析，与空白组相比较，模型组的 FSH、AMH差异均有统计学意义(P<0.05)，造模成功；与空白组相比，模型组的E2、LH、P差异无统计学意义(P>0.05)，但E2及FSH呈现下降趋势，详见表1。

2.3.2 血清学数据相关性分析

对最后1周的模型组小鼠血清学激素浓度与其卵巢血流动力学数据进行相关性分析，得到FSH与PP相关性差异有统计学意义(P=0.045，r=0.642)，两者之间有一定的相关性。PI与FSH，PP与PI之间相关性差异无统计学意义(P>0.05)(图5)。

表1 两组小鼠血清E2、FSH、LH、P、AMH浓度比较Tab.1 Content of E2，FSH，LH，P，AMH between two groups (，n=10)

**P<0.01vscontrol group;E2:estradiol in serum;FSH:follicle-stimulating hormone；LH:luteinizing hormone;P:progestational hormone;AMH:anti-Müllerian hormone.

图5 模型组小鼠FSH与PP相关性散点图Fig.5 Scatter plot of correlation between FSH and PP in model group mice

FSH:follicle-stimulating hormone；PP：pulse pressure；△1 mmHg=0.133 kPa.

3 讨论

超声检测小鼠卵巢形态和超声多普勒检测小鼠卵巢血流可以在短时间内较为明显地动态观察卵巢的形态的变化和血流的改变，并且可以动态监测卵巢的各项指标的变化。形态相关学指标包括卵巢面积、直径、卵泡个数和分布；血流指标包括RI、PI和PP。

形态相关指标可直观反映小鼠卵巢的变化，表现在卵巢面积变化和卵泡数目的增减。血流指标中，RI反映的是血管顺应性的大小，血管的顺应性降低，从而增加RI，血流受阻[6]。PI反映着血管对血液搏出能力的衡量，不仅取决于收缩期峰值流速(peak systolic velocity，PSV)和舒张末期血流速度(end diastolic velocity，EDV)，还与一个心动周期的平均流速有关[7]。PP是平均动脉压与平均静脉压的差值，反映着血管弹性与血管功能的一个指标。PP下降意味着血管弹性的下降，由于大动脉弹性减退使脉搏波传导速度增快，使得反射波抵达中心动脉的时相由舒张期变为收缩期，从而导致收缩压升高，舒张压降低，PP增大[8-9]。

POI小鼠卵巢分泌E2、P减少，造成对垂体FSH、LH的抑制减弱，导致血清FSH、LH浓度升高，引起卵泡数目急剧减少。FSH升高是卵巢功能减退引起的最早的激素变化，临床上FSH值高于40 IU/L。而高FSH同时伴有高LH,则标志着卵巢衰竭[10]。近年来发现，AMH具有调控卵泡生长和发育的作用[11]，是评价卵巢储备功能的敏感指标，故可将AMH定义为卵巢功能下降的指标[12]。

本研究通过超声动态观察小鼠卵巢的形态，可观察到POI小鼠卵巢面积发生改变，说明POI小鼠卵巢受到造模试剂的影响，其正常发育受到抑制。通过超声彩色多普勒成像可观察到，模型组的血流明显减少，说明POI小鼠的血流减弱，卵巢维持自身血供能力下降。PP的增加与小鼠年龄、性别和心率等有着密切的关系，反应的是模型组搏出量提高或顺应性降低。综合血流动力学结果的动态变化图，在统计学结果假阳性，没有重复测量方差分析的前提下，可初步推测模型组卵巢血管顺应性降低，血管弹性下降，进而导致卵巢功能的下降，致使卵巢血流量的减少。

相关性散点图直观显示模型组小鼠FSH与PP值呈正相关，提示FSH可能通过不同的途径来影响PP的变化。从神经-体液的角度，由垂体前叶嗜碱性细胞分泌的FSH可能通过体液运输，作用于卵巢血管上皮细胞，造成上皮细胞性质的改变，对血管的顺应性产生一定的影响，进而影响到血流，对PP造成影响。从分子的角度，FSH可能影响到了血管上皮细胞内的蛋白表达或者影响到了细胞内的某些信号通路，使上皮细胞产生生理性变化，进而影响到血流的变化，从而对PP造成影响，使PP发生相应变化。其他血流动力学数值与血清学激素数值经检验差异无统计学意义(P>0.05)，可能是由于样本量相对较少以及两个指数对PP的影响所造成。虽然RI和PI值在相关性检验结果上与FSH无相关性，但两者在两组之间呈现不同的趋势，可能是以PP的形式与FSH呈相关性，进而说明PP更能说明血流动力学与激素浓度的联系。

综上所述，继往相关性研究均采用离体实验方法，缺少对卵巢结构和功能的动态评价。通过高频小动物超声系统持续动态观察卵巢形态和血流变化，可观察到卵巢的结构、功能以及衰竭程度。这也对药物治疗的药效评价增加了一种新的手段，可以进一步通过药物干预，对卵巢功能的改善进行有效评价。如何使用有效的药物来干预POI小鼠并动态监测其变化，将是未来研究的方向。

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Correlativestudiesbetweenhaemodynamicsandsexhormoneconcentrationsinmicewithprimaryovarianinsufficiency

Feng Xunxun1,Dong Xiaoying2*,Zheng Xiurui1

(1.SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,InstituteofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo study the correlation between haemodynamics and sex hormone concentrations in mice with premature ovarian insufficiency (POI).MethodsBALB/c female mice model of POI was established by multiple sites subcutaneous injection of zona pellucida 3 of mice，and then ovaries were observed by applying ultrasound meanwhile hemodynamics changes were recorded by ultrasound color doppler.Finally,mice serum was taken to be detected.ResultsUnder the images of ultrasound,ovaries of mice in model group experience the volume decrease,follicle decrease and low blood flow.Compared to the blank group,mice of model group have lower pulsatility index (PI),higher resistance index (RI) and an ascending trend of pulse pressure (PP).Moreover,the follicle-stimulating hormone (FSH) and anti-Müllerian hormone (AMH) in mice of model group had a significant difference (P<0.05) compared to the blank group.Then,through the correlation test between haemodynamics and sex hormone concentrations,there was a significant difference in PP and FSH (P<0.05).ConclusionThe PP in haemodynamics and FSH in sex hormone concentrations have a significant difference and it can provide the base for dynamic observation in course of treatment.

POI;ultrasound blood flow;dynamic;sex hormone;correlation

北京市自然科学基金面上项目(7162026)，北京中医药薪火传承“3+3”工程项目(2012-SZ-C-41)，首都中医药科技专项(JJ2013-01)，首都医科大学中医药专项课题(15ZY05)。This study was supported by Natural Science Foundation of Beijing(7162026)，Eternal Flame“3+3” Project of Beijing Traditional Chinese Medicine(2012-SZ-C-41)，Capital Traditional Chinese Medicine Project(JJ2013-01)，Capital Medical University Traditional Chinese Medicine Project(15ZY05).

*Corresponding author，E-mail：softsongs@126.com

时间：2017-12-13 21∶26

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2126.062.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.023]

R711.75

2017-06-26)

编辑 慕 萌