杨梅素潜在作用靶点及机制计算机虚拟筛选研究

何侃亮，李 博，袁秋贞

陕西省中医医院药剂科(西安710003)

杨梅素潜在作用靶点及机制计算机虚拟筛选研究

何侃亮，李 博，袁秋贞△

陕西省中医医院药剂科(西安710003)

目的：探讨杨梅素发挥药理活性的作用靶点及其分子机制。方法：利用Pharmmapper及DRAR-CPI平台分别预测杨梅素潜在作用靶点，对所得靶蛋白进行文献挖掘分析；用STRING平台对预测靶点进行生物信息学分析，获得靶蛋白的注释、蛋白互作信息并进行通路富集分析。结果：杨梅素发挥抗癌作用的潜在作用靶点可能为Pim-1、EGFR，此外还与PI3K-Akt及MAPK通路有关。讨论：杨梅素可能通过胆碱酯酶和β-分泌酶，以及影响Neurotrophin、ErbB通路发挥改善认知功能及抑郁样行为的作用。

杨梅素(3，5，7，3'，4'，5'，-六羟基黄酮，Myricetin)又名杨梅树皮素，是黄酮醇类化合物，常见于茶叶、浆果以及草药中。近年来随着研究的深入，人们发现杨梅素具有抗癌、保护神经、抗氧化、抗炎等多种药理学活性[1]。众多研究表明，杨梅素对多种肿瘤细胞具有抑制生长、增殖及侵袭的作用，同时具有神经保护、抗炎等作用[2-3]。计算机辅助药物设计是指利用计算机进行理论计算，以减少采用传统实验手段筛选药物的工作量，提高新药研发成功的概率，主要包括虚拟筛选和药效团设计[4]。通常从天然中草药中分离得到的单体化合物可能具有药理学作用，但是需要大量细胞及动物实验加以验证或排除，费时费力；另一方面，某些已经上市销售多年的药物，因为对其分子靶标的认识程度不够，而没有认识到它的其他不良反应或者新作用。因此采用计算机虚拟筛选技术对天然产物进行研究十分有必要。为了探讨杨梅素的药理学效应，本研究将基于计算机虚拟筛选的方法，利用Pharmmapper和DRAR-CPI平台获得杨梅素可能的作用靶点，采用String平台对杨梅素的预测靶蛋白之间的相互作用进行分析，报告如下。

材料与方法

1 杨梅素分子结构的构建和准备 在SybylX2.0软件中构建杨梅素分子(图1A)，并对其进行预处理，对分子构象加载Gasteiger-Huckel电荷，采用Tirpos力场Minimize程序进行能量最小化，以最大次数1000，0.001kcal/mol作为收敛标准的Powel能量梯度法进行优化，得到稳定构象。

2 杨梅素潜在靶点预测 将杨梅素分子的mol2格式文件提交到Pharm mapper数据库，选择人类蛋白靶标数据库进行分析。Pharm mapper将对配体小分子和数据库中的药效团自动匹配，按照匹配分值 (fitscore)的大小输出分析结果。将杨梅素分子的mol2格式文件提交到服务器，平台运算后下载计算结果进行分析。服务器建议选取药物分子与蛋白质相互作用(chemical-protein)的Z-score<-0.5纳入为潜在靶点。

3 潜在作用靶点的生物过程和代谢通路分析 将筛选所得杨梅素靶点导入STRING平台，经平台进行分析获得蛋白质-蛋白质之间的相互作用，以及蛋白质的生物功能注释。通过提供PubMed相关信息摘要以及链接NCBI等其他数据库对蛋白靶点网络进行分析，如根据染色体临近、基因融合、基因共表达等多方面对结果进行综合评分，并根据分数高低对相关蛋白进行排序。同时，应用STRING进行靶蛋白的GO分析及KEGG信号通路富集分析。

结 果

1 基于Pharmapper的靶点预测 利用Pharm mapper对其数据库的7000余靶蛋白进行运算，结果按照Fit Score从大到小进行排序。得分排名前30的疾病相关蛋白靶点信息(图1)。配体与各靶蛋白的药效团匹配情况(图2)。

图1 构建杨梅素分子及排名前30的疾病相关蛋白靶点信息

图2 杨梅素与靶蛋白药效团叠合图

2 基于DRAR-CPI的靶点预测 DRAR-CPI结果中，依据Chemical-protein打分值共有98个蛋白靶点。杨梅素可能的作用靶点中，涉及细胞过程、代谢过程、免疫系统的靶点较多，如MAPK、TNK2、CDK2、PPAR等，我们进一步针对杨梅素与这几个蛋白的关系进行探讨，DRAR-CPI平台提供了杨梅素分子与靶蛋白的分子对接结果(图3)。结果显示，杨梅素与MAPK1的Docking Score为-43.8814，Z-Score为-1.80118，表明杨梅素与MAPK1可能有较好的结合；杨梅素与TNK2的Docking Score为-40.3406，Z-Score为-2.15523。相比MAPK1，TNK2的Docking Score值略高，但Z-Score值略低，但均处于小于平台推荐的-0.5范围内，且对接结果显示均有较好的结合。杨梅素与CDK2的Docking Score为-40.4291，Z-Score为-1.42111，同样存在较稳定的相互作用。以上结果表明，MAPK1、TNK2、CDK2可能是杨梅素发挥抗肿瘤活性的潜在重要作用靶点。

图3 杨梅素与靶蛋白的分子对接情况

3 潜在作用靶蛋白网络的构建及分析 我们使用STRING平台构建了杨梅素靶蛋白相互作用的网络图，如图4。图中共产生76个节点和229个边，每个节点代表一个预测的靶蛋白，线的颜色代表每种来自不同类型的证据，提示杨梅素潜在作用靶点间通过多条相互作用通路进行调节。从图中可以看出，MAPK1、EGFR、SRC、AKT1、PRKACA、SYK、NR3C1、GSK3B、PAK、PPAR等位于关键的节点位置，在蛋白互作网络中有着十分重要的地位，提示杨梅素可能通过这些蛋白发挥其药理学活性。

图4 DRAR-CPI预测所得靶蛋白的互作网络

4 靶点代谢通路分析 为杨梅素预测靶点的KEGG通路富集分析。部分通路情况如下：9个靶点蛋白参与ErbB信号通路(KEGG ID: 04012),12个靶点蛋白参与MAPK信号通路(KEGG ID: 04010)，8个靶点蛋白参与Neurotrophin信号通路(KEGG ID: 04722)，10个靶点蛋白参与癌症相关通路(KEGG ID: 05200)，15个靶点蛋白参与NF-κB信号通路(KEGG ID: 04064)，9个靶点蛋白参与PI3K-Akt信号通路(KEGG ID: 04151)。

讨 论

中国知网、Pubmed及Web of Science数据库中研究杨梅素的药理学活性，并与虚拟筛选平台所预测的靶点进行分析，结果显示Pharmmapper中得分最高的Pim-1(Z-score=1.05447)是基因Pim家族中的一员，调控细胞凋亡、分化、增殖进而参与肿瘤形成过程[5]。目前大量证据表明，杨梅素可剂量依赖性的抑制肿瘤细胞的生长、增殖与转移、促进肿瘤细胞凋亡等途径，发挥抗肿瘤作用。EGFR(Z-score=0.664508)是EGFR酪氨酸激酶家族的成员之一，其与配体结合导致构象变化，引发自身磷酸化，转导下游信号，进而调节细胞的增殖、凋亡等过程[6]。EGFR在肿瘤细胞中过度激活状态，使细胞周期失去调控，导致肿瘤细胞无限制生长。目前EGFR抑制剂已成为临床肿瘤病人治疗的重要药物，如酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼。预测结果提示，杨梅素可能通过调控Pim-1、EGFR进而发挥抗肿瘤作用，而这一机制仍需进一步利用动物和细胞水平实验进行验证。

胆碱酯酶(Z-score=0.645846)作为治疗阿尔茨海默症的重要靶点，被认为可影响乙酰胆碱的合成、释放及摄取进从而导致记忆力衰退。基于这一理论，多奈哌齐、石杉碱甲等乙酰胆碱酶抑制剂已被研制成功并成为目前主要的临床治疗药物。β-分泌酶(Z-score=0.460382)是一种Ⅰ型跨膜蛋白，通过在脑内切割β淀粉样蛋白前体蛋白形成β淀粉样蛋白，参与阿尔茨海默症的发生发展[7]。已有证据表明，杨梅素在大鼠中可以发挥神经保护的作用，但其涉及的分子机制有待进一步阐明。结合预测结果，我们可以认为杨梅素可能通过调控胆碱酯酶以及β-分泌酶的活性，影响下游的乙酰胆碱和β淀粉样蛋白，从而发挥保护神经的作用。

研究表明神经系统疾病的发病机制与Neurotrophin信号通路、ErbB信号通路密切相关[8]。其中ErbB通路的平衡对中枢神经系统的发育至关重要，ErbB4突变小鼠表现出与精神分裂症小鼠模型相同的行为学改变[9]。Ma等报道，给予杨梅素可以改善慢性应激后小鼠小鼠抑郁样行为，上调海马组织中脑源性神经营养因子(BDNF)表达水平[10]；Wang等最新研究同样表明，注射杨梅素可以改善慢性应激后小鼠的认知障碍，缓解学习能力的下降，升高海马组织BDNF蛋白表达量。BDNF为Neurotrophin信号通路中重要的上游因子，动物水平实验结果与我们虚拟筛选结果是一致的，表明杨梅素可以通过调控Neurotrophin信号通路发挥其保护神经作用。 但杨梅素与ErbB通路的研究目前尚无相关报道，这一机制有待进一步阐明。

大量研究表明，杨梅素可通过抑制肿瘤细胞的生长、增殖等途径发挥抗肿瘤作用。PI3K/AKT通路在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用，研究证实该通路的过度表达和活化能够引起肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭的异常。Yang等[3]最新研究表明，杨梅素可通过PI3K/AKT通路与MAPK通路，抑制人胎盘绒膜癌细胞侵袭迁移，并促进细胞凋亡。Phillips等研究发现，杨梅素可抑制Akt磷酸化，影响PI3K信号通路，从而抑制胰腺癌细胞的生长。本研究中通路分析预测，杨梅素的潜在靶点中9个参与PI3K-Akt通路。以上结果提示，杨梅素可以通过调控PI3K-Akt通路影响肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，MAPK信号转导途径参与了细胞的生长、发育、分裂死亡以及细胞间多种生化反应信号的识别传递过程。本研究中分子对接结果提示，杨梅素与MAPK1有较好的结合；靶点通路富集分析显示，杨梅素潜在作用靶点中有12个参与MAPK通路。 Kang等人报道，在鼠肺纤维细胞中，杨梅素可以通过调节MAPK通路发挥抗氧化作用，进而发挥保护细胞的作用。Fu等人研究发现，杨梅素也可以通过抑制MAPK通路的活化，从而降低鼠树突细胞的活化水平。结合本研究预测结果及文献报道可推测，杨梅素通过抑制MAPK通路中ERK、JNK及p38的活化发挥抗癌作用。

综上所述，我们利用不同的计算机虚拟筛选平台对杨梅素可能的作用靶点进行了分析，所得筛选结果与文献报道中针对杨梅素的分子机制研究一致，但仍有较多潜在作用靶点并未被动物或细胞水平实验所研究。杨梅素发挥神经保护作用的机制，可能与其对胆碱酯酶、β-分泌酶以及Neurotrophin、ErbB信号通路的调控有关；而其抗癌作用机制与重要潜在作用靶点Pim-1、EGFR有关，此外还可能通过调控PI3K-Akt、MAPK通路影响癌细胞生长、增殖及侵袭过程。本研究可为杨梅素发挥药理学活性作用机制的深入研究提供重要的理论依据和线索。

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△ 通讯作者

杨梅素 抗肿瘤药 计算机模拟 神经保护

R96

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.12.003

(收稿：2017-08-20)