黄鳝醛酮还原酶基因的重组表达及多抗制备

王全禾, 江 翱, 杨 震, 李 伟

( 1.长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434025; 2.武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430072 )

黄鳝醛酮还原酶基因的重组表达及多抗制备

王全禾1, 江 翱2, 杨 震1, 李 伟1

( 1.长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434025; 2.武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430072 )

为实现原核表达黄鳝醛酮还原酶基因并制备其多克隆抗体，笔者利用基因特异性引物自黄鳝肝脏cDNA中扩增黄鳝醛酮还原酶全长序列，将之克隆至原核表达载体pET-28a(+)中，构建了重组表达载体；经测序验证后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导。利用Ni离子亲和柱纯化了重组蛋白，通过多次免疫新西兰兔制备了多克隆抗体；采用Western blot和免疫组化法鉴定兔抗醛酮还原酶多克隆抗体的特异性，用间接ELISA技术检测多抗的效价。结果发现成功构建pET/ Eakr原核表达载体，并实现了重组蛋白的融合表达和纯化；Western blot检测表明制备的兔多克隆抗体不仅能特异性地识别来源于黄鳝4种组织的醛酮还原酶蛋白而且还可识别来源于黄颡鱼、团头鲂、乌鳢、鲫鱼和草鱼的同源蛋白。免疫组化结果提示该多抗可特异性识别黄鳝小肠、肝胰组织和脾脏的醛酮还原酶蛋白。制备的多抗效价达1∶6400。

黄鳝;醛酮还原酶;重组表达;多克隆抗体

黄鳝(Monopterusalbus)又称鳝鱼、无鳞公子等，为合鳃目、合鳃科、黄鳝属的唯一种。黄鳝属底栖型鱼类，通常在富含有机质的水草及水流较缓的溪流中钻洞穴居。由于肉质鲜美，含有丰富的氨基酸和维生素，又具有较高的药用和食用价值，黄鳝现已成为我国及亚洲许多国家淡水养殖中重要的养殖品种。醛酮还原酶(AKR)是一类依赖于NAD(P)H的分子量为34～37 ku的单体还原酶蛋白，在生物界广泛分布[1]。醛酮还原酶超家族成员众多，包含醛糖还原酶、醛还原酶、羟化类固醇脱氢酶、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶、多元醇脱氢酶、二氢二醇脱氢酶等多种能够代谢机体羰基化合物的酶类[2]。该超家族的蛋白质结构存在许多共性，如都包含一个(α/β)8的桶装结构、相似的辅酶结合结构域和一个高度保守的Asp, Tyr, Lys, His催化四分体[3-4]。从功能上看，它们在生物体应对外源性或内源性羰基化合物的解毒过程中具有重要作用[5-7]，许多成员还参与了某些疾病的发生过程[8]。研究表明，醛酮还原酶超家族与癌症侵袭、转移和耐药性等问题的发生密切相关[9-10]，在机体抗衰老[11]、生物体内氧化应激[2]、致癌化合物的降解[12-13]、糖尿病并发症及肿瘤发生[2,14-15]等过程都有醛酮还原酶超家族的参与。

相对于哺乳动物，关于鱼类的醛酮还原酶基因及其功能的研究国内外鲜有报道。国外有学者研究了苯并芘处理尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)后其肝组织醛酮还原酶 AKR1A1 基因的表达情况，认为尼罗罗非鱼的 AKR1A1 分子可能在苯并芘解毒过程中具有重要的作用[16]。而针对其他鱼类尤其是重要淡水养殖品种——黄鳝的醛酮还原酶基因及其功能的报道，目前尚无文献记载。前期，笔者于实验室克隆了黄鳝醛酮还原酶基因Eark，并发现该基因和已知醛酮还原酶家族的成员仅具有约25%的同源性。随后，笔者构建了该基因的原核表达载体，利用Ni离子亲和层析柱进行了重组蛋白的分离和纯化，并免疫新西兰兔(Oryctolaguscuniculus)制备了其多克隆抗体并进行了免疫组化和Western blot检测。该研究结果对于探究鱼类醛酮还原酶基因的功能具有重要的参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

试验所用的黄鳝、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、黄颡鱼(pelteobagrusfulvidraco)，团头鲂(Megalobramaamblycephala)、乌鳢(Ophiocephalusargus、鲫鱼(Carassiusaumtus)均购自荆州水产市场；试验所用的新西兰纯种白兔购自荆州兔业养殖合作社。pET-28a(+)载体购自 Novagen公司；限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ、LA Taq、T4连接酶购于大连宝生物；DH5α和BL21(DE3)感受态细胞、pEASY-T1载体、蛋白质marker购于北京全士金；IPTG、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；anti-His一抗、HRP标记羊抗兔IgG 购于武汉博士德公司；DAB显色试剂盒购自于武汉谷歌生物；动物组织总蛋白提取试剂盒购于上海贝博生物；Ni离子亲和层系柱购于上海七海生物；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 原核表达载体的构建

根据黄鳝醛酮还原酶基因的cDNA序列(序列号：KF819395)，设计了一对特异性引物re-ex-F(5′-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3′)和re-ex-R (5′- CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACTCATCGC-3′)以扩增该基因的成熟肽序列。分别在上、下游引物添加了EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点。扩增产物经过双酶切回收纯化，与同样双酶切的pET-28 a(+)表达载体进行连接。连接产物转化DH5α感受态细胞后进行菌液PCR初检和序列测定验证，测序正确的质粒命名为pET-Eakr。

1.2.2 重组蛋白的诱导表达

取1 ng重组质粒转化大肠杆菌(Escherichiacoli) BL21(DE3)，涂布于含50 μg/mL的卡那霉素平板上进行37 ℃过夜培养。挑取阳性转化子于含50 μg/mL的卡那霉素的液体LB培养基中37 ℃、200 r/min摇培至指数生长期后添加IPTG，使终浓度为0.1 mmol/L，培养3 h。离心收集菌体进行超声波破碎，然后加入5×上样缓冲液进行12% SDS-PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况。

1.2.3 重组蛋白的纯化

将上述阳性菌株按1∶100的比例接种于500 mL含有50 μg/mL的卡那霉素的新鲜液体培养基中，200 r/min 37 ℃恒温培养过夜。离心收集菌体，用50 mmol/L的PBS(pH 8.0)悬浮菌液进行超声波破碎。超声波破碎后收集沉淀部分，用裂解缓冲液(6 mol/L盐酸胍，10 mmol/L咪唑，50 mmol/L PBS pH=8.0)洗涤3次后，加入适量裂解缓冲液溶解，上清液经过滤后用1 mL的亲和层析镍柱His-Binding-Resin进行纯化，纯化的蛋白经含6、3、1.5、0.5 mol/L和0.1 mol/L的盐酸胍缓冲液梯度透析复性后，使用透析袋浓缩，用BCA法测定蛋白含量。

1.2.4 多克隆抗体的制备

将纯化的蛋白和等体积弗氏完全佐剂进行充分乳化后按照200 μg/kg的量采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔。每次间隔7 d，共注射8次。自第2次免疫开始，用经弗氏不完全佐剂充分乳化的抗原进行加强免疫。最后1次加强免疫后1周后采全血分离抗血清，加入30%甘油后，于-20 ℃分装保存。以第1次免疫前采集的兔血清为阴性对照。

1.2.5 多克隆抗体特异性的Western blot分析

首先将含有空白质粒的菌株总蛋白(阴性对照)、阳性菌株总蛋白(阳性对照)和纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转至NC膜上。分别用武汉博士德生物有限公司制备的anti-His(1∶2000倍稀释)及自制的兔抗血清1∶500倍稀释后作为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行多抗的特异性检测。

为进一步分析自制的抗血清的特异性，利用动物组织总蛋白提取试剂盒提取黄鳝肝胰脏、小肠、肌肉和脾脏4种组织的总蛋白。提取方法按照试剂盒说明书进行。总蛋白提取后取50 μg各组织总蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转至NC膜上。用制备的抗血清进行1∶500倍稀释后作为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行多抗的特异性检测。

1.2.6 黄鳝醛酮还原酶蛋白的免疫组化分析

采用石蜡包埋法包埋黄鳝的小肠、肝胰脏和脾脏, 以约6 μm厚度进行切片。常规脱蜡后，用50 μL的H2O2(3%)于37 ℃孵育10 min，阻断内源过氧化物酶。将切片放入柠檬酸盐缓冲液中并加热至沸腾，20 min后自然冷却。用10%山羊血清进行封闭后加入500倍稀释的兔抗醛酮还原酶抗血清37 ℃温育2 h，用TBST洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育30 min，DAB显色。苏木精复染、脱水透明及树胶封片。阴性对照以阴性血清代替一抗。

1.2.7 同源蛋白的Western blot分析

为分析其他不同种鱼体内是否存在醛酮还原酶的同源蛋白，采用动物组织总蛋白提取试剂盒提取草鱼、黄颡鱼、团头鲂、乌鳢和鲫鱼肝脏总蛋白用于兔抗醛酮还原酶抗血清的同源性蛋白检测。将50 μg不同种鱼来源的肝脏总蛋白进行常规SDS-PAGE电泳及转膜。用自制的兔抗醛酮还原酶抗血清进行1∶500倍稀释后作为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行Western blot检测。

1.2.8 多抗的效价分析

以纯化的重组蛋白为包被抗原，以第一次免疫前采集的兔血清为阴性对照，将兔抗Eakr蛋白多克隆抗体进行1∶200至1∶25600倍比稀释，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，以TMB为底物显色液，进行间接ELISA分析。以免疫血清样品D450 nm值/阴性对照血清D450 nm值≥2为阳性作为判定标准，制备的多克隆抗体的最大稀释度作为该抗体的有效效价。

2 结果与分析

2.1 原核表达载体的构建

利用含有限制性酶切位点的基因特异性引物 re-ex-F 和re-ex-R 从黄鳝肝脏cDNA中可扩增长为1044 bp的条带，而对重组菌进行的菌液 PCR 扩增的产物大小和预期相符；随之，将阳性重组质粒用 EcoRⅠ和 Hind Ⅲ进行酶切鉴定，获得了1条约 1100 bp的条带和1条约5000 bp长的条带(图1)。进一步的测序结果表明，黄鳝醛酮还原酶序列已经成功克隆至 pET-28a(+)中。

图1 菌液PCR扩增和双酶切验证重组质粒M: DNA分子量标准; 1: PCR扩增结果; 2: 双酶切结果.

2.2 重组蛋白的诱导表达和纯化

阳性重组菌经 0.1 mmol/L IPTG诱导4 h后，黄鳝醛酮还原酶在大肠杆菌中实现了高效融合表达。与对照组相比，阳性重组菌表达了1条蛋白分子量约为 37 ku的重组蛋白，与用软件预测的蛋白分子量相符，表明已经成功构建了原核表达载体。经过Ni亲和层析柱分离纯化得到了含有His标签的重组蛋白(图2)。

图2 黄鳝醛酮还原酶蛋白小量表达SDS-PAGE检测CK1:阴性对照; CK2:阳性对照; 1: 重组质粒诱导; 2: 纯化的黄鳝醛酮还原酶.

2.3 多克隆抗体的特异性检测

将上述纯化的蛋白进行定量后经过多次免疫新西兰大白兔制备了兔抗醛酮还原酶抗血清。采用Western blot的方法检测了自制抗血清的特异性。结果发现，采用商品化的anti-His作为一抗，重组菌总蛋白和纯化的醛酮还原酶蛋白都可以产生特异性的反应，只有1条带出现，而对照组则未产生反应，说明重组蛋白以融合了His标签的形式存在(图3a)。而自制的兔抗醛酮还原酶抗血清也可以特异性地和纯化的蛋白产生1条特异条带；在和重组菌总蛋白反应时产生了1条分子量较小的条带，可能是过量表达的杂蛋白产生的非特异性反应导致(图3b)。

为进一步分析多抗是否与黄鳝组织总蛋白产生特异性反应，将制备的多抗血清作为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗进行了Western Blot分析。结果表明，来源于肝胰组织、小肠、肌肉和脾脏的总蛋白都可以和自制的兔抗醛酮还原酶抗血清产生特异性的反应，而且4种组织里带型和分子量大小均一致(图3c)，说明制备的兔多克隆抗体具备良好的特异性和应用价值。

2.4 黄鳝体内醛酮还原酶蛋白的免疫组化分析

由免疫组化检测结果可知，醛酮还原酶蛋白在黄鳝小肠中的整体分布较为分散，且在肠道内壁突出的绒毛根部分布相对较多(图4b)，在肝胰组织和脾脏中分布较为集中，主要在肝胰组织和脾脏中的部分细胞中表达(图4d，f)。 而阴性对照未检出醛酮还原酶蛋白的表达，这些结果表明制备的兔抗醛酮还原酶多克隆抗体特异性较高，具备组织检测的应用价值。

图3 黄鳝Eark重组蛋白的Western blot检测1.重组菌总蛋白； 2.纯化的黄鳝醛酮还原酶蛋白.a:商品anti-His 作为一抗； b:自制的兔抗醛酮还原酶抗血清作为一抗; c: 组织蛋白检测.

2.5 其他鱼醛酮还原酶同源蛋白的检测

为进一步验证制备的兔抗醛酮还原酶抗血清的应用价值，将制备的多抗血清作为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗进行了Western Blot检测草鱼等5种淡水鱼醛酮还原酶蛋白的同源蛋白的表达情况。结果表明，所检测的5种淡水鱼的肝脏组织总蛋白都可以特异性的和制备的多抗产生反应，且5种鱼的醛酮还原酶同源蛋白分子量比较一致，均约37 ku(图5)，该结果表明鱼类的醛酮还原酶广泛存在于淡水鱼的不同物种，且制备的多抗具有比较高的应用价值。

2.6 抗血清的效价分析

纯化的重组蛋白多次免疫新西兰大白兔后获得的抗血清通过间接 ELISA 方法检测了其效价，结果显示，制备的抗血清效价较高，阳性血清的最高稀释度为 1∶12800，有效效价达到1∶6400(图6)。

图4 抗血清的免疫组化分析a、c、e为阴性对照；b、d、f为抗血清.

图5 抗血清对醛酮还原酶同源蛋白的Western blot检测1.草鱼； 2.黄颡鱼； 3.团头鲂； 4.乌鳢； 5.鲫鱼.

图6 兔抗黄鳝醛酮还原酶抗血清的效价

3 讨 论

醛酮还原酶超家族是广泛分布在生物界的具有辅酶依赖性的氧化还原酶的集合[3-4]。现报道的醛酮还原酶超家族成员有16个亚家族共约190多个成员[2]。通过辅酶NAD(P)H 提供还原力，醛酮还原酶可以将醛酮类化合物通过加氢的方式还原成相对应的醇类化合物，从而降低毒害作用[17]。其底物包括脂肪类醛酮化合物、芳香类化合物、醛糖、儿茶酚胺、甾类、视黄醛、前列腺素、黄曲霉素等[2,8]。有些醛酮还原酶除了参与了机体的疾病发生过程，还作为重要的防御酶存在[18]。醛酮还原酶抑制剂在癌症及糖尿病并发症临床治疗等方面具有重要的意义，目前已成为研究的热点[2,19-20]。对于鱼类这些低等脊椎动物的醛酮还原酶基因及其功能报道非常匮乏，亟需深入研究。笔者重组表达并制备了黄鳝醛酮还原酶的多克隆抗体，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

原核表达重组基因是研究醛酮还原酶基因功能的重要途径之一。大肠杆菌醛酮还原酶 AKR15A1 在重组菌株中的过量表达可有效提高菌株对丙酮醛和甘油醛的毒害作用的耐受性，具有重要的羰基解毒作用[21]。通过检测组织分布也可推测醛酮还原酶的生物学功能。Macleod等[22]利用 Western blot 技术和免疫组织化学技术检测出 AKR1B13、1D2 这两种醛酮还原酶在在小鼠脾、肝、肾和肺等组织中的表达水平以及表达位置分布，推测出其在哺乳动物机体中主要阻止酚类物质被氧化。Endo等[12]利用免疫组化检测出AKR1C15 在细支气管细胞、肺泡细胞、胃壁细胞、上皮细胞和血管内皮细胞中的表达及分布，并结合体外底物筛选结果推断出 AKR1C15 在小鼠机体内主要起到防御有毒羰基化合物毒害作用。抗体也是从蛋白质水平上研究基因功能的重要工具。制备高效价、特异性强的抗体对于研究其抗原基因的表达、定位及其行使的生物学功能至关重要[23]。笔者重组表达了黄鳝的醛酮还原酶基因，并制备了其多克隆抗体。用多抗进行的免疫组化检测显示黄鳝醛酮还原酶在小肠、肝脏和胰脏的组织分布及表达水平存在很大差异； 而Western blot结果表明，黄鳝不同组织里的醛酮还原酶分子量相似；同时应用制备的多抗检测其他淡水鱼，结果也发现存在着醛酮还原酶的同源蛋白。这说明此类新的醛酮还原酶亚家族成员可能广泛存在于淡水鱼中并且行使着相似的重要生物学功能。该研究结果为研究鱼类的醛酮还原酶的功能提供了重要参考资料。

[1] Jez J M, Bennett M J, Schelgel B P, et al. Comparative anatomy of the aldo-keto reductase superfamily [J]. Biochem Journal, 1997, 326(3):625-636.

[2] Penning T M.The aldo-keto reductases (AKRs): overview[J].Chemico-Biological Interactions, 2015(234):236-246.

[3] Mindnich R D,Penning T M.Aldo-keto reductase (AKR) superfamily: genomics and annotation [J].Human Genomics, 2009,3(4):362-370.

[4] Sanli G,Dudley J I,Blaber M.Structural biology of the aldo-keto reductase family of enzymes [J].Cell Biochemistry and Biophysics, 2003,3(1):79-101.

[5] Sengupta D,Naik D,Reddy A R.Plant aldo-keto reductases (AKRs) as multi-tasking soldiers involved in diverse plant metabolic processes and stress defense: a structure-function update[J].Journal of Plant Physiology, 2015(179):40-55.

[6] Kanayama Y, Mizutani R, Yaguchi S, et al. Characterization of an uncharacterized aldo-keto reductase gene from peach and its role in abiotic stress tolerance[J]. Phytochemistry, 2014,104(3):30-36.

[7] Chang Q, Harter T M, Rikimaru L T, et al.Aldo/keto reductases as modulators of stress response[J]. Chemico-Biological Interactions, 2003,143/144(2): 325-332.

[8] Rižner T L,Penning T M.Role of aldo-keto reductase family 1 (AKR1) enzymes in human steroid metabolism[J].Steroids, 2014, 79(1):49-63.

[9] Matsumoto R, Tsuda M, Yoshida K, et al.Aldo-keto reductase 1C1 induced by interleukin-1β mediates the invasive potential and drug resistance of metastatic bladder cancer cells[J].Scientific Reports, 2016(6):34625.

[10] Chow R K, Sin S T, Liu M, et al.AKR7A3 suppresses tumorigenicity and chemoresistance in hepatocellular carcinoma through attenuation of ERK, c-Jun and NF-κB signaling pathways[J].Oncotarget, 2016，doi: 10.18632/oncotarget.12726.

[11] Davydov V V.Age-specific peculiarities of modulation of blood aldo-keto reductase isoenzyme spectrum [J].Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2015, 160(2):199-201.

[12] Endo S,Matsunaga T,Mamiya H,et al.Characterization of a rat NADPH-dependent aldoketo reductase (AKR1B13) induced by oxidative stress [J].Chemico-Biological Interactions, 2009, 178(1/3):151-157.

[13] 李丹,张岐山,周立娜,等.敲减AKR1A1基因对H2O2及 4-羟基壬烯醛诱导的1321N1脑星形细胞瘤细胞损伤的影响[J].细胞与分子免疫学杂志, 2013, 29(3):273-276.

[14] 张秋艳,龚晓健.多元醇通路: 糖尿病性白内障药物干预的重要靶标[J].药学进展,2013,37(4):145-152.

[15] 蔡秋香,廖端芳,祖旭宇,等.醛酮还原酶超家族的研究进展[J].医学综述, 2008, 14(24):3693-3695.

[17] Hyndman D,Bauman D R,Heredia V V,et al.The aldo-keto reductase superfamily homepage[J]. Chemico-Biological Interactions, 2003, 143/144(2):621-631.

[18] Li D,Ellis E M,Ferrari M.Human aldo-keto reductase AKR7A2 protects against the cytotoxicity and mutagenicity of reactive aldehydes and lowers intracellular reactive oxygen species in hamster V79-4 cells [J].Chemico-Biological Interactions,2012, 195(1):25-34.

[19] Zhang L,Zhang H,Zhao Y.Inhibitor selectivity between aldo-keto reductase superfamily members AKR1B10 and AKR1B1: role of Trp112 (Trp111) [J]. FEBS Letters, 2013,587(22):3681-3686.

[20] Huang L, He R, Luo W, et al. Aldo-keto reductase family 1 member B10 inhibitors: potential drugs for cancer treatment. [J]. Recent Pat Anticancer Drug Discov,2016,11(2):184-196.

[21] Lapthorn A J, Zhu X, Ellis E M. The diversity of microbial aldo/keto reductases fromEscherichiacoliK12 [J]. Chemico-Biological Interactions, 2013, 202(1/3):168-177.

[22] Macleod A K, Kelly V P, Higgins L G, et al. Expression and localization of rat aldo-keto reductases and induction of the 1B13 and 1D2 isoforms by phenolic antioxidants [J]. Drug Metabolism & Disposition the Biological Fate of Chemicals, 2010, 38(2):341-346.

[23] 崔亚飞,姚学萍,雍康,等.奶牛S100A12 蛋白多克隆抗血清的制备[J].动物医学进展, 2012, 33(6):77-80.

RecombinantExpressionandPolyclonalAntibodyPreparationofanAldo-ketoReductasefromSwampEel

WANG Quanhe1, JIANG Ao2, YANG Zhen1, LI Wei1

( 1.College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; 2.College of Life Science, Wuhan University, Wuhan 430072, China )

A pair of gene-specific primers were synthesized to isolate the sequence of AKR of swamp eelMonopterusalbusfrom the liver cDNAs to recombinant expression of swamp eel aldo-keto reductase inEscherichiacoliand to prepare polyclonal antibody against it. The purified products were subcloned into expression vector pET-28a(+). Subsequently, the confirmed plasmid pET/Eakr was transformed into BL21(DE3) competent cells. The positive clones were selected and were induced by IPTG. Then, the recombinant protein was purified by one step affinity chromatography with a Ni-NTA agarose column. New Zealand white rabbits were immunized with the purified protein to generate polyclonal antibodies. Western-blotting and immunohistochemistry assay were performed to detect the specificity of the antibody. Indirect ELISA was used to examine the titer of the antibody. The results showed that the antiserum specifically recognized Eakr in four different tissues of swamp eel and reacted with homologous proteins in grass carpCtenopharyngodonidella, yellow catfishPelteobagrusfulvidraco, bluntnose black breamMegalobramaamblycephala, snakeheadChannaargusand crucian carpCarassiusauratus. Immunohistochemistry assay revealed that the antiserum specifically reacted to Eakr in kidney, liver and intestine with antibody titer of about 1∶6400.

swamp eel; aldo-keto reductase; recombinant expression; polyclonal antibody.

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.020

S917

A

1003-1111(2017)06-0804-06

2017-01-13；

2017-03-09.

国家大学生创新创业训练计划项目(201510489007)；湿地生态与农业利用教育部工程研究中心开放课题项目(KF2015016).

王全禾(1991—)，男,硕士研究生;研究方向:水产养殖. E-mail: douyuanjinjiao@sina.com.通讯作者:李伟(1976—)，男, 副教授；研究方向:鱼类分子生物学. E-mail: wetli@yangtzeu.edu.cn.