诺氟沙星对中国圆田螺氨基比林-N-脱甲基酶活性的影响

王宏伟，杨丽坤，赵文博，李林锋，邢清朝，谢恒辉

( 1.河北大学 生命科学学院, 河北 保定 071002； 2.天津武清区杨村一中，天津 300000 )

诺氟沙星对中国圆田螺氨基比林-N-脱甲基酶活性的影响

王宏伟1，杨丽坤1，赵文博1，李林锋1，邢清朝1，谢恒辉2

( 1.河北大学 生命科学学院, 河北 保定 071002； 2.天津武清区杨村一中，天津 300000 )

在沉积物中均匀加入诺氟沙星，模拟研究了沉积物中诺氟沙星对中国圆田螺不同组织氨基比林-N-脱甲基酶活性的影响。结果表明，诺氟沙星的处理使中国圆田螺各组织中的氨基比林-N-脱甲基酶活性发生了变化，不同和相同含量诺氟沙星对同种或不同组织中氨基比林-N-脱甲基酶的活性的影响不同。总的趋势为：低含量诺氟沙星对肝、肾、胃等组织氨基比林-N-脱甲基酶活性的作用为前期诱导后期抑制；中、高含量诺氟沙星抑制肾、胃等组织氨基比林-N-脱甲基酶活性；诺氟沙星一直抑制卵巢和肌肉组织中氨基比林-N-脱甲基酶的活性。

中国圆田螺；诺氟沙星；氨基比林-N-脱甲基酶活性

诺氟沙星属于氟喹诺酮类抗菌药，近年广泛用于防治水产养殖的病害[1]，但残留物对环境的影响不可忽略，尤其是沉积物对底栖生物造成影响[2]。这些残留物经过生物浓缩、生物放大等作用及食物链传递对人类健康也会有影响。中国圆田螺(Cipangopaludinachinensis)，俗称螺蛳、田螺，是中国各淡水水域的底栖生物，很多人喜食，对环境具有指示作用，但相应的研究工作很少。本试验模拟中国圆田螺的生存环境，研究了沉积物中不同含量诺氟沙星对中国圆田螺肝、肾、胃、卵巢以及肌肉5种组织器官的药物代谢Ⅰ相酶氨基比林-N-脱甲基酶活性的影响[3]，以期探讨诺氟沙星对中国圆田螺代谢的影响，为评价水产品对人类健康的安全性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

中国圆田螺取自河北白洋淀，平均质量(5.89±1.75) g，壳高(31.40±5.08) mm，壳宽(18.81±1.88) mm，试验前中国圆田螺暂养3 d，以适应试验环境。取12个2 L白瓷缸，每个缸放入经高锰酸钾溶液消毒过的细沙200 g，同时加入根据文献[4]中诺氟沙星的环境含量范围配制的诺氟沙星母液，按诺氟沙星与沉积物(细沙)质量比分别为0 μg/g(空白对照组)、500 μg/g(低含量组)、1000 μg/g(中含量组)、1500 μg/g(高含量组)配制，每组3个平行。沿缸壁加曝气水至150 mL，将其静止24 h后，每个缸内加入中国圆田螺10只。试验过程中，水温(23±1) ℃，pH 7.0～7.2，溶解氧10.1～10.3 mg/L。在试验的第2、4、6、8、10 d分别测定各组螺肝、肾、胃、卵巢、肌肉5个组织中的氨基比林-N-脱甲基酶活力。测定各组螺肝、肾、胃、卵巢、肌肉5个组织中氨基比林-N-脱甲基酶活力时，各采3只螺(即每个平行取1只)，作为平行样本，以减少误差。解剖中国圆田螺，分别在肝、肾、胃、卵巢、肌肉等部位用解剖针和剪刀取10 μg组织，放入研钵中(4 ℃预冷)，加入990 μL蒸馏水[5]，研碎，制成1∶100(m/V)的组织匀浆，吸入1.5 mL离心管，4 ℃，3000 r/min离心10 min，取上清液。试验用酶标仪(普朗医疗器械公司)，诺氟沙星纯度高于98%(天津市化学试剂一厂)，氨基比林-N-脱甲基酶测定试剂盒(上海沪尚生物科技有限公司)。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附测定法。

1.2 氨基比林-N-脱甲基酶活力测定

氨基比林-N-脱甲基酶活性的酶联免疫吸附法测定：加样参照表1。用封板膜封住反应孔，37 ℃恒温箱温育60 min，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静止1 min，甩去洗涤液，吸水纸上排干，重复洗板5次(表1)。15 min内，在450 nm波长处测定各孔OD值(表2)。

表 1 氨基比林-N-脱甲基酶活力测定试剂盒加样量及测定过程 μL

表2 不同含量标准品的OD值

氨基比林-N-脱甲基酶标准曲线的制定：根据表2操作测得120、60、30、15、7.5、0 U/L标准品的OD值。在Excel工作表中，以标准品含量作为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线(图1)。

图1 氨基比林-N-脱甲基酶标准品曲线

1.3 数据处理

试验结果为3次测定值的平均值，数据误差线为标准误差，采用SPSS 13.0统计软件对数据进行单因素方差分析，P<0.05表示处理组与对照组差异显著，用*表示。

2 结 果

2.1 肝脏组织氨基比林-N-脱甲基酶的测定结果

中国圆田螺肝脏组织氨基比林-N-脱甲基酶活性的变化见图2。由图2可知，除低含量组(500 μg/g)第4、6 d和8 d外，其他试验组均表现出显著性差异，暴露第2 d时氨基比林-N-脱甲基酶活性显著升高；第4 d时低含量组无显著差异，中含量组(1000 μg/g)氨基比林-N-脱甲基酶活性显著上升，高含量组(1500 μg/g)氨基比林-N-脱甲基酶活性显著下降；第6、8 d时，低含量组氨基比林-N-脱甲基酶活性无显著变化，中、高含量组活性显著下降；第10 d时，低含量组氨基比林-N-脱甲基酶活性显著上升，另外两试验组氨基比林-N-脱甲基酶活性显著下降。这种变化表明，低含量诺氟沙星处理前期诱导肝脏组织氨基比林-N-脱甲基酶活性，中期影响不大；而中、高含量诺氟沙星在处理前期诱导氨基比林-N-脱甲基酶活性，后期表现为抑制，含量越高诱导作用持续时间越短。

图2 中华圆田螺肝脏组织氨基比林-N-脱甲基酶活性变化*表示与对照组比较有显著性差异(P<0.05).余同.

2.2 肾脏组织氨基比林-N-脱甲基酶的测定结果

中国圆田螺肾脏组织氨基比林-N-脱甲基酶活性变化见图3。由图3可知，低含量诺氟沙星暴露组第4 d时，中国圆田螺肾中氨基比林-N-脱甲基酶活性显著上升，第8 d时，氨基比林-N-脱甲基酶活性显著下降，其余时间段无显著影响。中含量诺氟沙星组除第8 d 氨基比林-N-脱甲基酶活性显著受抑制外，其余时间均为显著诱导。高含量诺氟沙星组暴露第2 d和6 d时氨基比林-N-脱甲基酶活性显著升高，其余时间则显著下降。这表示低含量诺氟沙星组肾脏组织氨基比林-N-脱甲基酶活性作用表现为先诱导后抑制；中含量诺氟沙星组影响的总趋势为抑制作用；而高含量诺氟沙星组的作用与低含量组相似，呈先诱导后抑制。

2.3 胃组织氨基比林-N-脱甲基酶的测定结果

诺氟沙星对中国圆田螺胃组织氨基比林-N-脱甲基酶活性的影响见图4。由图4可知，暴露第2 d时，低含量组氨基比林-N-脱甲基酶活性上升，其余组氨基比林-N-脱甲基酶活性下降；第4 d时，低、中含量组酶活性上升，高含量组显著下降；第6 d时，低、中含量组氨基比林-N-脱甲基酶活性显著下降，高含量组无明显变化，第8 d时，各含量组酶活性达到峰值，各试验组中氨基比林-N-脱甲基酶活性显著下降；第10 d时，试验组氨基比林-N-脱甲基酶活性显著高于对照组, 表明低含量诺氟沙星对胃组织氨基比林-N-脱甲基酶活性的作用为先诱导后抑制，高、中含量组对氨基比林-N-脱甲基酶活性的作用为抑制。

图3 中国圆田螺肾脏组织氨基比林-N-脱甲基酶活性变化

图4 中国圆田螺胃组织氨基比林-N-脱甲基酶活性变化

2.4 卵巢组织中氨基比林-N-脱甲基酶活性的测定结果

诺氟沙星对中国圆田螺卵巢组织中氨基比林-N-脱甲基酶的活性变化见图5。由图5可知，低含量诺氟沙星组在暴露第2、4、10 d时，氨基比林-N-脱甲基酶活性显著下降，第6、8 d时氨基比林-N-脱甲基酶含量显著高于对照组；中含量诺氟沙星组处理第2 d氨基比林-N-脱甲基酶活性无显著变化；第4 d酶活性显著上升，其余时间显著下降；高含量组除第10 d酶活性的受限制程度高于对照组，其他时间均显著低于对照组，表明诺氟沙星对氨基比林-N-脱甲基酶活性均表现为抑制作用。

图5 中国圆田螺卵巢组织氨基比林-N-脱甲基酶活性变化

2.5 肌肉组织氨基比林-N-脱甲基酶的测定结果

诺氟沙星对中国圆田螺肌肉组织中氨基比林-N-脱甲基酶活性的影响见图6。由图6可知，第2、4 d时各个试验组氨基比林-N-脱甲基酶活性均低于对照组。第6、8 d时低含量组肌肉组织氨基比林-N-脱甲基酶活性无明显影响，中含量组在第6 d时氨基比林-N-脱甲基酶活性显著高于对照组，第8 d时低于对照组；高含量组则相反；第10 d时，低、中含量组氨基比林-N-脱甲基酶活性显著低于对照组，高含量组则高于对照组。这表明诺氟沙星对肌肉组织氨基比林-N-脱甲基酶活性的作用为抑制作用。

3 讨 论

低含量短时间的暴露处理使中国圆田螺肝脏中的氨基比林-N-脱甲基酶活性显著升高，对氨基比林-N-脱甲基酶表现出诱导作用，这与Li 等[5]的试验研究结果相似，而接下来的几天与对照组没有显著性差异，这与其他研究结果不太一致，可能是由于中国圆田螺的机体适应能力所致；当暴露第10 d时酶的活性显著上升，说明低含量的诺氟沙星可使中国圆田螺氨基比林-N-脱甲基酶活性升高，进而使其有更高的药物代谢功能；中含量与高含量的诺氟沙星暴露试验过程中分别在第6 d和第4 d以后显示出对氨基比林-N-脱甲基酶的抑制作用，这种结果说明诺氟沙星对中国圆田螺肝脏组织氨基比林-N-脱甲基酶活性具有抑制作用，且这种抑制作用存在一定的时间和剂量效应, 这可能与药物含量高、暴露时间长, 药物在中国圆田螺体内的残留时间较长有关。

肾脏是生物的排毒器官，对药物的排泄起重要的作用。本试验结果表明，中、高含量组处理下中国圆田螺肾脏组织氨基比林-N-脱甲基酶活性先升后降再上升。初步认为，由于天气较热，暴露环境中容易滋生细菌，对中国圆田螺的生长有很大的负面影响，诺氟沙星的杀菌作用有利于试验组螺的存活，因此在暴露前期对照组酶活性低于这两组的酶活。在试验后期高含量组螺肝脏组织氨基比林-N-脱甲基酶活性低于空白组，说明药物积累对中国圆田螺肝脏氨基比林-N-脱甲基酶的活性的负面影响，甚至比细菌的危害还要大。

在诺氟沙星的作用下，胃组织氨基比林-N-脱甲基酶的活性呈现出不规律的波动趋势，总的趋势还是先诱导后抑制，其原因可能是胃食物中的诺氟沙星对胃壁产生了影响，由于个体差异，每一只中国圆田螺的胃中的食物不可能完全一致，因此产生波动的趋势，说明胃组织不适合作为药物残留或者酶活测定的指标。

在诺氟沙星的作用下，卵巢的氨基比林-N-脱甲基酶活性全都表现出抑制的效应。试验时期为中国圆田螺的繁殖期，这个时期卵巢非常敏感，因此尽管在低含量作用前期，其氨基比林-N-脱甲基酶活性也是被抑制的状态。

在诺氟沙星作用下，肌肉中氨基比林-N-脱甲基酶活性的变化趋势与卵巢一样，其原因可能是中国圆田螺的足直接与沉积物中的药物接触，诺氟沙星直接并快速对肌肉起作用，快速在肌肉中蓄积。

4 结 论

本试验中，处理前期，各含量诺氟沙星对肝脏组织氨基比林-N-脱甲基酶活性有诱导作用，随含量升高，药物的诱导作用持续时间变短，诱导力度减小，后期则呈现抑制作用。在肾脏和胃组织中，低含量诺氟沙星对氨基比林-N-脱甲基酶活性先诱导后抑制，而中高含量对氨基比林-N-脱甲基酶为抑制作用。各含量诺氟沙星对敏感卵巢或直接接触的肌肉氨基比林-N-脱甲基酶有抑制作用，含量越高抑制程度越大，但对中国圆田螺无明显的致死效应。低含量的诺氟沙星对中国圆田螺氨基比林-N-脱甲基酶活性有显著诱导作用，可以有效降解其他毒性物质，含量较高时不仅不能促进解毒作用，甚至可能会因为抑制氨基比林-N-脱甲基酶活性而使其对其他药物的抗性降低，并沿着食物链进入人的生产生活中。因此，必须重视诺氟沙星以及其他抗生素的污染，及时有效治理。

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EffectsofNorfloxacinonActivityofEnzymeAminopyrineN-Demethylase(APND)inSnailCipangopaludinachinensis

WANG Hongwei1, YANG Likun1, ZHAO Wenbo1, LI Linfeng1，XING Qingchao1，XIE Henghui2

( 1. College of Life Sciences,Hebei University, Baoding 071002, China；2. Middle School No. 1 at Yang Village, Wuqing District, Tianjin Municipality，Tianjin 300000，China )

The effects of norfloxacin blended in sediments on activity of aminopyrine N-demethylase(APND) were studied in different tissues of snailCipangopaludinachinensisin simulation. The results showed that different concentrations of sedimentary norfloxacin had different influence on the activity of the enzyme. For example，there were increase tendency in activities of enzyme in liver, kidney and stomach at the beginning of the experiment at low concentrations，and then decrease tendency, while the activities of enzyme in kidney and stomach were inhibited at middle and high concentrations of sedimentary norfloxacin. The activities of enzyme were shown to be declined in muscle and ovary.

Cipangopaludinachinensis；norfloxacin；aminopyrine-N-demethylase (APND)

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.020

S966.281

A

1003-1111(2017)04-0519-05

2016-07-08；

2016-09-12.

国家自然科学基金联合资助项目(U1133005)；教育部留学回国基金资助项目(2014-2016)；河北省高层次人才项目(C2015003034)； 河北省自然科学基金资助项目(D2013201105)；河北省重点实验室运行补助费资助项目(14967611D)；河北省生物学强势特色学科建设项目(2016)；生物学河北省国家重点学科培育项目(2016)；河北大学中西部高校提升综合实力工程项目(2016)；河北大学2016年国家级创新创业训练计划项目(201610075014)；河北大学2016年研究生创新项目(X2016072)；河北大学2016年校级创新创业训练计划项目(2016084); 河北大学2016年实验室开放项目(sy201662).

王宏伟(1970—)，女，教授，硕士生导师，博士；研究方向：水生生物学. E-mail：13722283189@126.com.