结直肠癌术前腹腔液不同CA125基因表达水平对手术预后的相关性研究

朱新峰，林坚

（1.山东济宁市第二人民医院 普外科，山东 济宁 272049；2.广西医科大学第一附属医院 胃肠腺体外科，广西 南宁 530012）

结直肠癌术前腹腔液不同CA125基因表达水平对手术预后的相关性研究

朱新峰1，林坚2

（1.山东济宁市第二人民医院 普外科，山东 济宁 272049；2.广西医科大学第一附属医院 胃肠腺体外科，广西 南宁 530012）

目的探讨结直肠癌术前腹腔液不同CA125基因表达水平与手术预后的相关性。方法收集2014年6月‐2016 年5月在山东济宁市第二人民医院接受手术治疗的结直肠癌患者70例，纳入结直肠癌组,另选择同期行手术治疗的结直肠良性疾病患者35例为对照组，两组患者均采集腹腔液，并采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）技术进行CA125基因检测，分析结直肠癌患者腹腔液中CA125基因表达与临床病理的关系，以CA125基因平均表达为界分高表达组和低表达组，比较高表达组、低表达组术后1年的复发转移率和生存率情况。结果结直肠癌组术前腹腔液标本的CA125基因表达水平为（1.75±0.26），显著高于对照组的（0.20±0.03）（t =35.069，P =0.000）；术后1个月结直肠癌组腹腔液标本的CA125基因表达水平为（0.38±0.07），明显低于同组患者术前的（1.75±0.26）（t =42.569，P =0.000）；低分化、浸润深度为T3～4、TNM分期为III～IV期、有淋巴结转移和远处转移患者的术前腹腔液CA125基因表达水平明显分别高于高-中分化、浸润深度为T1～2、TNM分期为I～II期、无淋巴结转移和无远处转移患者（P ＜0.05）；术后随访1年，高表达组患者复发转移率为81.25%（26/32），明显高于低表达组患者的39.47%（15/38）（χ2=12.494，P =0.01）；高表达组患者术后1年生存率为62.50%（20/32），明显低于低表达组患者的89.47%（34/38）（χ2=7.168，P =0.07）。结论腹腔液CA125基因检测可作为结直肠癌筛查的辅助方法，为患者的预后评估及进一步治疗提供依据。

结直肠癌；腹腔液；CA125

结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，其发生率在所有恶性肿瘤中位居第三，且近年来有增长的趋势[1]。手术是结直肠癌的有效治疗手段。但临床约30%～40%的结直肠癌手术患者终因术后复发并肿瘤转移而死亡[2]。因此如何在早期检测出腹腔微转移，降低术后复发率，评估手术预后具有重要意义。CA125是机体存在肿瘤的重要指标，其广泛存在于乳腺癌、胃癌和结直肠癌等恶性肿瘤中，临床上常用于消化系统肿瘤的辅助诊断。近10年来，随着诊断技术进步，特别是实时荧光定量聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）技术的应用，极大提高了腹腔内肿瘤切除术过程中腹腔液内微量CA125的检出率，这为结直肠癌手术切除患者的预后评估提供了依据。本研究采用RT-PCR技术对结直肠癌患者术前腹腔液内CA125基因表达进行检测，探讨其表达水平与手术预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年6月‐2016年5月在山东济宁市第二人民医院接受手术治疗的结直肠癌患者70例，纳入结直肠癌组，其中，男45例，女25例；年龄35～86岁，中位年龄61岁；结肠癌48例，直肠癌22例；肿瘤类型：隆起型、溃疡型和浸润型；病理分期I期13例，II期30例，III期27例；手术方式为开腹结直肠癌根治术，术后病理检查确诊为结直肠癌；排除原发大肠癌、术前放化疗、同时或既往患其他恶性肿瘤、合并急性肠梗阻或穿孔需急诊手术者；诊断及分期标准按1997年国际抗癌联盟和美国癌症联合会（Union for International Cancer Control,UICC）修订标准[3]。另选择同期行手术治疗的结直肠良性疾病患者35例作为对照组，其中，男24例，女11例；年龄32～73岁，中位年龄48.9岁；结直肠腺瘤22例，结直肠息肉11例，先天性巨结肠1例，溃疡性结肠炎1例。本实验取材均告知患者或其家属并征得同意,且经过本院医学伦理委员会批准，两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 主要试剂及设备 CA125及U6引物序列（北京丰寿实业有限公司）、RT-PCR试剂盒（武汉默克尔生物技术有限公司）、RNA提取试剂盒（RNAisoTMPlus）（北京天根生化科技有限公司）、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（上海翊圣生物科技有限公司）和RNA酶蛋白质抑制剂（RNasin）（上海索莱宝科技有限公司）；紫外分光光度仪（上海奥析科学仪器有限公司）；H1-16KR型低温高速离心机（上海松朗电子仪器有限公司）；晶芯RT-cycler RT-PCR仪（北京博奥晶典生物技术有限公司）和安捷伦2100芯片生物分析仪（中国安捷伦科技有限公司）。

1.2.2 标本采集 无腹腔积液的患者，取一根16 号导尿管留置腹腔，注入200 ml生理盐水，轻轻搅动后吸出；有腹腔积液患者则用50 ml注射器抽出腹腔积液50 ml。采集完标本后，室温状态静置30 min后，3 000 r/min离心20 min，过滤获得沉淀并加入新的离心管，-40℃保存；结直肠癌组患者腹腔液标本分别在术前、术后1个月时采集。

1.2.3 腹腔液CA125基因检测 ①提取RNA：根据RNAisoTMPlus试剂盒的操作方法提取腹腔液标本中总RNA；用紫外分光光度仪测定RNA并评估纯度，安捷伦2100芯片生物分析仪分析RAN分子完整性；将RNA样品置于-40℃保存。②合成cDNA 混合反应体系的建立（25 μl）：2.5 μl dNTP（10 μmol/μl）、2 μl RNasin（20 u/μl）、总 RNA 8 μg、5.5 μl无 RNA 酶 水、6 μl MMLV反转录酶（5 u/μl）、1 μl随机引物（0.1 μg/ μl）、5×反转录缓冲液8 μl；反应条件：42℃反转录20 min→95℃灭活反转录酶5 min→4℃ 5 min。③RT-PCR反应 反应体系的建立（25 μl）：12.5 μl SYBR Green PCR预混液、8 μl无RNA酶水、2.5 μl模 板 cDNA、1 μl PCR 上 游 引 物 和 1 μl PCR下游引物；反应条件：93℃，3 min预变性，（95℃15 s；退火60℃ 20 s；72℃ 40 s）×40循环，内参基因为3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。CA125基因表达强度以GAPDH标化后的相对值表示，采用2-△△CT法计算。

1.3 术后随访

结直肠癌组患者术后随访1年，根据参考文献资料[4]推荐的标准,结直肠癌组患者术前腹腔液的平均CA125基因表达水平为界，高于平均值者纳入高表达组，低于平均值者纳入低表达组；记录高表达组、低表达组随访期间的复发转移及生存情况。

1.4 统计学方法

应用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析。结果中计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；中位年龄组间比较采用非参数秩和检验；计数资料以百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组与对照组术前腹腔液标本的CA125基因表达情况

结直肠癌组术前腹腔液标本的CA125基因表达水平为（1.75±0.26），显著高于对照组的（0.20±0.03）（t =35.069，P =0.000）；术后 1 个 月结直肠癌组腹腔液标本的CA125基因表达水平为（0.38±0.07），明显低于同组患者术前的（1.75±0.26）（t =42.569，P =0.000）。

2.2 术前腹腔液CA125基因表达与结肠癌患者病理特征的相关性

术前腹腔液CA125基因表达水平与结肠癌患者年龄、性别及肿瘤大小无明显相关性（P ＞0.05）；低分化、浸润深度为 T3～4、TNM 分期为 III～IV期、有淋巴结转移和远处转移患者的术前腹腔液CA125基因表达水平明显分别高于高-中分化、浸润深度为 T1～2、TNM 分期为 I～II期、无淋巴结转移和无远处转移的患者（P ＜0.05）。见表1。

2.3 术前腹腔液不同CA125基因表达水平结直肠癌患者的手术预后情况

结直肠癌患者术前腹腔液平均CA125基因表达水平为1.74，术前腹腔液CA125基因表达水平 ≥1.74患者32例，纳入高表达组；38例术前腹腔液CA125基因表达水平＜1.74的患者，纳入低表达组；术后随访1年，高表达组患者复发转移率为81.25%（26/32），明显高于低表达组患者的39.47%（15/38）（χ2=12.494，P =0.01）；高表达组患者术后1年生存率为62.50%（20/32），明显低于低表达组患者的89.47%（34/38）（χ2=7.168，P =0.07）。

表1 术前腹腔液CA125基因表达与结肠癌患者病理特征的相关性 （±s）

表1 术前腹腔液CA125基因表达与结肠癌患者病理特征的相关性 （±s）

项目 例数 CA125基因表达 t值 P值年龄/岁≤61 37 1.77±0.28 0.783 0.902＞61 33 1.71±0.36性别男34 1.76±0.30 0.737 0.937女36 1.70±0.38大小≤3 cm 42 1.69±0.30 1.278 0.832＞3 cm 28 1.79±0.35分化程度高-中分化 40 1.57±0.31 5.284 0.000低分化 30 1.99±0.34浸润深度T1～2 43 1.18±0.25 16.732 0.000 T3～4 27 2.53±0.43 TNM分期I～II期 44 1.32±0.29 12.623 0.000 III～IV 期 26 2.45±0.46淋巴结转移是21 2.30±0.38 12.781 0.000否49 1.22±0.30远处转移是11 2.86±0.49 18.207 0.000否59 1.08±0.25

3 讨论

结直肠癌手术后复发转移是引起患者预后不良的重要因素[5]。腹膜是结直肠癌常见的转移部位，据调查报道，结直肠癌患者中约有30%～40%存在术后腹膜的复发转移[6]。腹腔内残留癌细胞和残余微小转移灶是术后早期腹膜转移的主要形式[7]，且目前影像学手段难以检出。因此需寻找一种预测结直肠癌患者是否存在腹膜转移的方法，以便准确评估其手术预后并尽早采取有效的干预措施，对改善其手术预后，提高生存率具有较高的临床价值。对腹腔液进行脱落细胞学检查可以发现游离癌细胞，从而判断结肠癌细胞的腹膜转移情况。然而腹腔液细胞数量极少，且癌细胞的形态学多已出现改变，易与炎性细胞、腹腔内皮细胞相混淆，因此假阴性较高，敏感度较低[8]。

PCR可对样品内的目标基因进行扩增，有较高的灵敏度和特异度，目前在多种疾病诊断中均有应用。CA125是一种黏液性糖蛋白，作为肿瘤标记物，能用于乳腺肿瘤、消化道肿瘤等肿瘤的良恶筛查，还能用来评估术后的疗效。有研究证实，结直肠患者腹腔液存在CA125基因的表达，可能是由于血中CA125基因渗入腹腔或是由于突破腹膜间皮屏障进入腹腔的肿瘤细胞死亡破裂后将CA125基因释放入腹腔[9]。向德雨等[10]研究发现，RT-PCT检测腹腔液中CA125基因表达对结直肠癌腹膜微转移的检出率明显高于脱落细胞学检查。

本研究对结直肠癌患者腹腔液CA125基因表达采用RT-PCR技术检测，发现，结直肠癌组术前腹腔液标本的CA125基因表达水平显著高于对照组患者（P ＜0.05），提示对腹腔液CA125基因表达进行RT-PCR检测可辅助结直肠癌的筛查。同时发现，术后1个月结直肠癌组腹腔液标本的CA125基因表达水平明显低于同组患者术前水平（P ＜0.05），其原因可能是结直肠癌灶切除后，癌旁组织或正常组织及可能残留的癌细胞极少，致使CA125基因减少，从而释放进入腹腔的CA125基因也减少；另外在癌灶切除后，免疫功能恢复，致使残留肿瘤细胞对CA125基因表达降低。因此通过术后1个月复查腹腔液CA125基因表达水平可进一步了解术后肿瘤残留及机体免疫功能恢复情况。

有研究报道，结直肠癌腹腔转移与其分化程度及浸润深度有关，且常发生在结肠癌晚期；患者术前腹腔液CA125基因表达与肿瘤的病理特征密切相关[11]。本研究结果显示，结直肠癌患者术前腹腔液CA125基因表达与分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移及远处转移有关，这与上述研究结果相符，提示腹腔液CA125基因表达对结肠癌的诊断及预后评估具有积极意义。本研究对结肠癌患者术后进行1年随访，发现术前腹腔液CA125基因高表达患者术后1年复发转移率明显高于低表达者，生存率明显低于低表达者，说明结直肠癌患者术前腹腔液CA125基因检测可判断其是否存在腹腔播散，其可作为结直肠癌患者预后的评估指标，为临床医生制定针对性治疗提供依据。

尽管结直肠癌患者腹腔液CA125基因检测的灵敏度高于脱落细胞学检查，但其特异性仍不高，故有一定的假阳性。且以腹腔液CA125基因检测来评估结直肠癌患者术后复发转移及生存率，还需更多的随机对照研究证实。总而言之，腹腔液CA125基因检测可作为结直肠癌筛查的辅助方法，为患者的预后评估及进一步治疗提供依据。

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R735.35；R735.37

B

10.19338/j.issn.1672-2019.2017.10.021

2017-06-23

（刘东京 编辑）