复方盐酸特比萘芬凝胶抗皮肤癣菌感染的组织病理学疗效观察

吴燕 孔健 袁海龙 张福成

(空军总医院药学部，北京 100142)

·论著·

复方盐酸特比萘芬凝胶抗皮肤癣菌感染的组织病理学疗效观察

吴燕 孔健 袁海龙 张福成

(空军总医院药学部，北京 100142)

目的通过病理学研究评估外用抗真菌药-复方盐酸特比萘芬凝胶对常见皮肤癣菌的抗炎和抗真菌疗效。方法采用须癣毛癣菌感染豚鼠皮肤，建立动物模型，用4种皮肤外用制剂治疗，通过考察豚鼠病变皮肤的恢复情况，比较复方盐酸特比萘芬凝胶的治疗效果。结果在治疗须癣毛癣菌感染豚鼠的皮肤真菌病方面，复方盐酸特比萘芬凝胶的疗效优于盐酸特比萘芬凝胶 (P＜0.05)、曲安奈德益康唑乳膏 (P＜0.01)和糠酸莫米松凝胶 (P＜0.01)。结论复方盐酸特比萘芬凝胶对豚鼠皮肤须癣毛癣菌感染的治疗和预防复发效果较好。

须癣毛癣菌；病理；复方盐酸特比萘芬凝胶

盐酸特比萘芬属于丙烯胺类药物，具有广谱抗真菌活性。它能特异地干扰真菌麦角固醇的早期生物合成，高选择性抑制真菌麦角鲨烯环氧化酶，使真菌细胞膜形成过程中麦角鲨烯环氧化反应受阻，从而达到杀灭或抑制真菌的作用[1-2]。糠酸莫米松是一种合成的中效糖皮质激素，具有抗炎、止痒、抗过敏的作用[3]。皮肤浅部和皮下真菌感染影响皮肤、毛发、甲和黏膜组织，其中皮肤癣菌致全球数百万人感染，导致头癣、股癣、手足癣、体癣和甲真菌病并伴随炎症反应[4]。治疗皮肤癣菌感染时，通常局部外用抗真菌药物，目前市售的药品中大多都未注重炎症的消退，并且都是基于临床的观察，并未进行病理的研究。笔者自制了含有抗炎、抗过敏和抗真菌的复方盐酸特比萘芬凝胶，并采用须癣毛癣菌感染豚鼠皮肤构建动物模型，用4种皮肤外用制剂给药治疗，考察模型豚鼠病变皮肤的恢复情况，比较药物的疗效。

1 材料和方法

1.1 菌株

须癣毛癣菌 (Trichophytonmentagrophytes)1株 (71896)由临床最新分离，引自北京医科大学附属第一医院皮肤科真菌室。其又称石膏样毛癣菌，属于毛癣菌属，可侵犯皮肤、指 (趾)甲和毛发，引起的体癣皮疹表现为环状或不规则形，局部炎症明显，周围可有丘疹和水疱，愈后不留色素沉着[5]。

1.2 实验动物

Hartley豚鼠 (36只)，白色，雌雄各半，体重 (250±50) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养条件：温度22～28℃，相对湿度50%～60%，每笼1只，以防止互相吃舔药物。喂豚鼠块料，自由饮食、饮水。人工照明12 h。

1.3 药物

复方盐酸特比萘芬凝胶 (每克含盐酸特比萘芬10 mg，糠酸莫米松0.5 mg，批号：20150501，空军总医院)，盐酸特比萘芬凝胶 (每克含盐酸特比萘芬10 mg，批号：20150815，空军总医院)，醋酸曲安奈德益康唑乳膏 (每克含硝酸益康唑10 mg，曲安奈德1 mg，批号：150715242，西安杨森制药有限公司)，糠酸莫米松凝胶 (每克含糠酸莫米松0.5 mg，批号：150728，空军总医院)。

1.4 建立豚鼠真菌感染模型

菌悬液制备 将受试菌株接种在沙氏琼脂培养斜面或培养皿上，28℃培养7～14 d后，用生理盐水冲洗菌落，过滤，制成菌悬液，并将浓度调节至 (1～2)×108CFU/mL，备用。

动物模型构建 豚鼠真菌感染模型建立的方法：实验动物环境适应性饲养1周后，用剃须刀刮去受试动物背部的毛，刮毛区面积为4 cm×4 cm，将其中心部位用记号笔标记成2.5 cm×2.5 cm正方形，再用无菌砂纸打磨，以点状出血为宜。用75%乙醇消毒，待干燥后取上述菌悬液100 μL，均匀涂布于皮肤破损面[6]。

豚鼠真菌感染模型成功的判断：动物皮肤感染1周后，皮损局部出现红斑、脱屑、糜烂、结痂，皮损取材直接镜检可见菌丝和孢子，皮损取材真菌培养出源感染菌；皮损组织病理学HE染色检查可见明显的炎症反应，PAS染色显示在角质层或在毛囊周围可见真菌菌丝和孢子。

分组及给药 须癣毛癣菌感染豚鼠随机分组，每组9只：复方盐酸特比萘芬凝胶治疗组 (a组)，盐酸特比萘芬凝胶治疗组 (b组)，曲安奈德益康唑乳膏治疗组 (c组)，糠酸莫米松凝胶治疗组 (d组)，分别外涂相应药物进行治疗，每感染区用药0.2 mL (0.2 g)，2次/d，连续给药3周，停药1周。每周取豚鼠背部皮肤，做病理切片，观察其恢复情况。

病理试验方法 病理取材时把病变部位分为4个象限，在治疗第7、14、21 d和停药7 d，依次取豚鼠感染区不同象限的皮肤组织 (每次各组取相同象限的皮肤组织)，用10%甲醇溶液固定，采用常规石蜡包埋，切片，经HE和PAS染色，显微镜下进行炎性评价和病理真菌检查。

1.5 评价标准

炎性评分以角质层增厚、棘细胞层增厚、中性粒细胞浸润、淋巴细胞浸润和真皮毛细血管扩张、充血、水肿情况作为评分指标，病理真菌检查以角质层是否存在真菌及菌量情况、棘细胞层是否存在真菌及菌量情况、毛囊周围是否存在真菌及菌量情况作为评分指标，每项均为正常 (-)、轻度 (+)、中度 (++)、重度 (+++)，分别以0、1、2、3计分，以此两项指标的综合评分之和对每组的治愈率进行比较。

1.6 统计与分析

数据釆用SPSS 13.0软件进行分析。组间比较釆用Two-Independent-Samples检验；计数资料釆用Chi-Squaretest检验 (χ2检验)。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 真菌感染豚鼠皮肤模型皮损结果 (见图1)

2.2 真菌感染豚鼠皮肤组织病理学结果

真菌感染7 d后，皮损肉眼观察可见每组均有红斑、大量白色鳞屑、结痂等症状；组织病理切片观察，HE染色中炎症反应明显，均表现出角质层、棘细胞层增厚，中性粒细胞、淋巴细胞浸润，真皮毛细血管扩张、充血等症状，且PAS染色检出真菌，在角质层，棘细胞层和毛囊周围可见大量菌丝和孢子，表明真菌模型构建成功。见图2。

2.3 各组治疗周期内的疗效评价

分别在给药第7天、第14天、第21天和停药7 d取皮肤病理组织进行观察评分，复方盐酸特比萘芬凝胶组 (a组)与各组之间差异均具有统计学差异 (P＜0.05)，见表1和表2，病理结果见图3～图8。

在治疗周期内，通过HE染色观察炎性症状的恢复时，复方特比萘芬凝胶组恢复较快，盐酸特比萘芬凝胶对照组，因不具有抗炎药物成分，炎性症状较明显，豚鼠皮肤真皮层有大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞和中性粒细胞为主，其中角质层和棘层增厚情况、真皮毛细血管扩张，充血情况明显。曲安奈德益康唑乳膏对照组在给药期间其对豚鼠皮肤的刺激性较大，豚鼠反应较强烈，疗效与实验组相比，效果较差。糠酸莫米松组因只含抗炎成分，不含抗菌药物，炎性症状较反复，提示真菌感染往往伴随炎症的发生。PAS染色观察真菌菌量情况时，通过治愈率的比较，各组之间的差异均具有统计学意义。

图1 实验周期内各组真菌感染豚鼠皮肤模型皮损结果

图2真菌感染7 d豚鼠皮肤组织病理学观察 (未给药；1、2、3为HE染色结果×100、×200、×400，4、5、6为PAS染色结果×100、×200、×400；箭头A.角质层增厚，B.棘细胞层增厚，C.淋巴细胞、中性粒细胞浸润，D.毛细血管扩张、充血，E.须癣毛癣菌菌丝)

Fig.3Histopathological observation of guinea pig skin after 7 days of fungal infection (1,2,3 for HE staining results ×100,×200,×400;4,5,6 for PAS staining results ×100,×200,×400;A.Stratum corneum thickening;B.Prickle cell layer thickening;C.Lymphocyte and Neutrophil infiltration;D.Telangiectasia,congestion;E.Trichophyton mentagrophytes mycelium)

通过4种制剂对须癣毛癣菌感染豚鼠模型治疗7 d、治疗14 d、治疗21 d和停药7 d的皮肤组织病理观察，发现复方盐酸特比萘芬凝胶兼具抗炎和抗真菌的疗效，豚鼠病变皮肤病情恢复的较为迅速，且治愈后停药1个月无复发，连续真菌培养均为阴性，比曲安奈德益康唑乳膏、盐酸特比萘芬凝胶和糠酸莫米松凝胶具有更好的疗效。

表1 各组给药后治愈率

Tab.2Comparison of pathological results of four drugs in treating guinea pigs treated byTrichophytonmentagrophytes

组别给药7d给药14d给药21d停药7da组4．83±0．413．50±0．550．83±0．410．83±0．41b组5．83±0．41∗4．33±0．52∗1．33±0．521．16±0．41c组6．83±0．75∗∗5．00±0．63∗∗3．00±0．89∗∗3．83±0．98∗∗d组7．17±1．17∗∗5．33±0．82∗∗3．83±0．41∗∗3．67±0．52∗∗

注：a组.复方盐酸特比萘芬凝胶组,b组.盐酸特比萘芬凝胶组,c组.曲安奈德益康唑乳膏组,d组.糠酸莫米松凝胶组;各组分别与a组相比，*表示两组病理结果评分比较，具有显著性差异，P＜0.05；**表示两组病理结果评分比较，具有极显著性差异，P＜0.01

由此可知，在治疗须癣毛癣菌感染豚鼠的皮肤真菌病方面，复方盐酸特比萘芬的疗效优于盐酸特比萘芬凝胶 (P＜0.05)、曲安奈德益康唑乳膏 (P＜0.01)和糠酸莫米松 (P＜0.01)。

3 讨 论

本实验采用磨砂法构建动物感染真菌模型，能够更好的对接种的菌量进行控制，随机分组，尽可能减小实验动物间感染程度不同的误差。同类复方制剂中，无上市销售的凝胶剂，在综合考虑复方成分比例和抗菌疗效后，选用临床疗效较好的进口药曲安奈德益康唑乳膏作为阳性对照药，乳膏和凝胶所用基质均未有抗炎和抑菌作用的报道，空白组结果显示空白基质对实验无影响 (见图1)。本制剂中糖皮质激素的配伍选用糠酸莫米松，本品具有抗炎、抗过敏的作用，其特点为作用强度增加而副作用不成比例增加，且外用生物利用度小于0.1%，全身性不良反应小[7]；与其他局部用糖皮质激素相比，本品具有较高疗效，且不易引起皮肤萎缩或肾上腺功能抑制等作用[8]。

图3给药7 d豚鼠皮肤组织病理学观察 (HE染色结果，×100)：a组相较b、c、d 3组炎性症状消退明显；b、c、d 3组均存在角质层增厚、棘细胞层增厚和炎性细胞浸润图4给药7 d豚鼠皮肤组织病理学观察 (PAS染色结果，×100)：a、b组抗菌效果较好；c组角质层和毛囊周围仍存在有菌丝；d组镜下可见大量菌丝图5给药14 d豚鼠皮肤组织病理学观察 (HE染色结果，×100)：a组炎性症状基本消退；b、c组相较a组存在棘细胞层增厚和炎性细胞浸润等现象；d组存在角质层增厚、棘细胞层增厚和炎性细胞浸润图6给药14 d豚鼠皮肤组织病理学观察 (PAS染色结果，×100)：a组全部治愈；b组基本痊愈；c组仍有部分毛囊周围存在菌丝；d组毛囊周围菌丝明显图7停药7 d豚鼠皮肤组织病理学观察 (HE染色结果，×100)：a组恢复正常；b、c组有轻微棘细胞层增厚和少量炎性细胞浸润；d组因不具有抗菌成分炎性症状较反复，伴有角质层增厚、棘细胞层增厚和炎性细胞浸润图8停药7 d豚鼠皮肤组织病理学观察 (PAS染色结果，×100)：a、b组未复发；c组仍有部分毛囊周围存在菌丝；d组毛囊周围存在菌丝 (a.复方盐酸特比萘芬凝胶组，b.盐酸特比萘芬凝胶组，c.曲安奈德益康唑乳膏组，d.糠酸莫米松凝胶组)

Fig.3Tissue pathology of guinea pig skin after 7-day treatment (HE staining results,×100):compared b,c,d three groups,inflammatory symptoms of a group subsided significantly;b,c,d three groups were stratified thickening,spine cell layer thickening and inflammatory cell infiltrationFig.4Tissue pathology of guinea pig skin after 7-day treatment (PAS staining results,×100):a,b groups antibacterial effect was better;there were still hyphae around the stratum corneum and hair follicles in c group;d group of microscopic visible myceliumFig.5Tissue pathology of guinea pig skin after 14-day treatment (HE staining results,×100):a group of inflammatory symptoms subsided;b,c group compared with a group of spine cell layer thickening and inflammatory cell infiltration and so on;d group there was stratum corneum thickening,spine cell layer thickening and inflammatory cell infiltrationFig.6Tissue pathology of guinea pig skin after 14-day treatment (PAS staining results,×100):a group all cured;b group basically recovered;group c part of the hair follicle was around the hyphae;d group hair follicle was around the hyphaeFig.7Histopathological observation of guinea pig skin 7 days after withdrawal (HE staining results,×100):a group returned to normal;b,c groups with mild spine cell layer thickening and a small amount of inflammatory cell infiltration;group d was not allergic to antibacterial components,with stratum corneum thickening,spine cell layer thickening and inflammatory cell infiltrationFig.8Histopathological observation of guinea pig skin 7 days after withdrawal (PAS staining results,×100):a,b groups without recurrence;group c was part of the hair follicle was still around the hyphae;d group hyphae around the hair follicle (a.Compound terbinafine hydrochloride gel;b.Terbinafine hydrochloride gel;c.Triamcinolone acetonide,Econazole nitrate cream;d.Mometasone furoate gel)

复方盐酸特比萘芬凝胶组相比曲安奈德益康唑乳膏组 (P＜0.01)，见效快，治愈率高，且复发率低；相比盐酸特比萘芬凝胶组 (P＜0.05)，在治疗前1周炎症反应消退明显，红斑、鳞屑消退快，表现为瘙痒感减退；相比糠酸莫米松凝胶组 (P＜0.01)，起效快，疗效显著。盐酸特比萘芬与糠酸莫米松复配形成的复方盐酸特比萘芬凝胶均充分地发挥了其效力，故该制剂治疗浅部真菌病疗效更优。通过本研究，表明复方盐酸特比萘芬凝胶可提高须癣毛癣菌感染的治愈率，并能减少复发，且抗炎效果较好。

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Histopathologicalobservationofterbinafinehydrochloridegelagainstdermatophytesinfection

WU Yan,KONG Jian,YUAN Hai-long,ZHANG Fu-cheng

(1.TheGeneralHospitalDepartmentofPharmacyofAirForce，Beijing100142)

ObjectiveTo assess the anti-inflammatory and anti-fungal efficacy of compound terbinafine hydrochloride gel as a topical antifungal drug for common dermatophytosis by pathological methods.MethodsGuinea pig skin was infected byTrichophytonmentagrophytesto establish animal model.Treated them with four topical preparations and then investigated the recovery of their affected skin,comparing the therapeutic effect of compound terbinafine hydrochloride gel with other three formulations.ResultsIn terms of curing guinea pig skin infected byTrichophytonmentagrophytes,compound terbinafine hydrochloride gel was more effective than terbinafine hydrochloride gel (P＜0.05),triamcinolone acetonide,econazole nitrate cream (P＜0.01) and mometasone furoate gel (P＜0.01).ConclusionsCompound terbinafine hydrochloride gel had better effect in the treatment and relapse prevention of guinea pig skin infection ofTrichophytonmentagrophytes.

Trichophytonmentagrophytes;pathology;compound terbinafine hydrochloride gel

[Chin J Mycol，2017，12(5):283-287]

R 978.5

A

1673-3827(2017)12-0283-05

吴燕，女 (汉族)，博士，副主任药师.E-mail:Wuyan2001@163.com

张福成,E-mail:yanjiushi1010@126.com

2017-05-01

[本文编辑] 卫凤莲