壳聚糖抗氧化效果的研究

张凤洪 王立红 李源 董惠峰/鼎正动物药业（天津）有限公司

黄艳兴/天津市蓟州区牧业发展服务中心

壳聚糖抗氧化效果的研究

高晶晶/天津国际生物医药联合研究院

张凤洪 王立红 李源 董惠峰/鼎正动物药业（天津）有限公司

黄艳兴/天津市蓟州区牧业发展服务中心

壳聚糖（聚β(1，4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖）是甲壳素N-脱乙酰基的产物，化学名称是，广泛存在于虾蟹、昆虫的甲壳中，研究显示壳聚糖对机体具有清除自由基、抵抗过氧化损伤等作用。据统计，全世界范围内加工虾蟹所产生的废弃物——虾蟹壳，每年可达1.54×108t，这些废弃物给环境带来了严重的污染。从环境保护和废物利用的角度出发，试验前期从废弃的虾蟹壳内采用酸浸一碱解法和浓碱水解法提取加工得到甲壳素衍生物——壳聚糖。本实验通过测定壳聚糖提取物对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基的清除作用及金属螯和能力，对虾蟹壳提取的壳聚糖抗氧化效果进行研究，旨在为废弃虾蟹壳壳聚糖的回收利用相关研究提供理论依据。

一、试验材料与方法

（一）试验材料

从虾蟹壳内提取分离的壳聚糖；VC，医药纯；邻二氮菲，硫酸亚铁，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris），邻苯三酚，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，铁氰化钾，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）等为分析纯。

（二）试验方法

1.壳聚糖对自由基的清除作用

（1） 采用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测壳聚糖对羟基自由基的清除作用。取1 ml 0.75 mol/L邻二氮菲溶液加入2 ml PBS溶液，分别与1 ml不同浓度的样品液充分混匀，加入0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液1 ml与0.01% H2O21 ml，于 37℃下温育 60 min，于 536 nm处测其吸光度As。同时以去离子水作为空白对照组，检测其Ab，不加样品加H2O2测Ap。以Vc为标准对照，按下式计算羟自由基清除率：

清除率(D%)=(As-Ap)/(Ab-Ap)×100

（2）采用邻苯三酚自氧化法检测壳聚糖对超氧阴离子自由基的清除作用。取2.4 ml pH 8.2 Tris-HCl缓冲液，加入不同浓度的样品液0.1 ml，混匀后加入8 mol/l的邻苯三酚溶液0.3 ml，混匀，4 min后加入1滴浓HCl溶液中止反应，测得A325值，以去离子水为对照测A0，以Vc为标准对照，按下式计算超氧阴离子自由基清除率：

清除率(D%)=(A0-A325)/A0×100

（3） 清除DPPH自由基能力的测定。壳聚糖清除DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基能力的测定。配制5种不同质量浓度的样品。取2 ml样品加入2 ml，含0.2 mmol/l DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）的无水乙醇溶液，混匀，常温反应30 min，在波长517 nm处测定吸光度（Ai）。将样品换为无水乙醇，测定吸光度（Ao），同时，测定2 ml样品液和2 ml无水乙醇混合液的吸光度（Aj），计算清除率I。

以抗坏血酸Vc做阳性对照，实验重复3次，取平均值。

2.金属鳌合能力的测定

参考Decker 等的方法测定金属鳌合能力。样品管中加入不同浓度壳聚糖溶液1 ml，再加入3.7 ml蒸馏水、0.1 ml 2 mmol/L 的FeCl2溶液混合均匀，最后加入0.2 ml 5 mmol/L的菲洛嗪启动反应，空白管用蒸馏水代替样品液，标准管用蒸馏水代替FeCl2溶液，以上三组在室温放置10 min后，在562 nm 测定吸光值，用EDTA作为阳性对照，设三组平行，用以下公式计算金属螯合能力（%）

金属螯合能力（%）=[A空白-（A样品-A标准）]/A空白×100

二、结果与分析

（一）壳聚糖对自由基的清除作用

（1）采用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测壳聚糖对羟基自由基的清除作用。以Vc为参照，研究了壳聚糖对羟基自由基的清除作用，从图1看出Vc和泥壳聚糖均随着浓度的升高，清除羟基自由基的能力增强，并且在一定的浓度范围内，抑制率与浓度均呈现良好的线性关系，壳聚糖对羟基自由基的清除作用稍弱于Vc的清除作用。

图1 Vc和壳聚糖对羟自由基的清除作用

（2）采用邻苯三酚自氧化法检测壳聚糖对超氧阴离子自由基的清除作用。壳聚糖对超氧阴离子自由基结果见图2，随着浓度的增加，Vc和壳聚糖对超氧阴离子自由基的清除作用逐渐增强，当浓度增加到2.0 mg/ml以上时对自由基的清除作用减慢，但总体说来Vc对超氧阴离子自由基的清除作用强于壳聚糖。

图2 Vc和壳聚糖对超氧阴离子自由基的清除作用

（3）清除DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基能力的测定。壳聚糖对DPPH自由基的清除作用在质量浓度0.1～0.5 mg/ml的范围内，壳聚糖清除DPPH自由基的能力随质量浓度增大而增大，且呈良好的线性正相关，Vc的线性方程：y=108.24x+48.516 R2=0.9255， 壳 聚 糖 的 线 性 方 程 ：y=86.78x+38.85 R2=0.9165。以清除率为50% 时样品的质量浓度值作为评价对自由基清除能力的指标，即半数清除质量浓度。由线性相关方程可得，Vc和壳聚糖清除DPPH 自由基的半数清除质量浓度值分别为0.014 mg/ml和0.128 mg/ml。

图3 壳聚糖对DPPH自由基的清除率

（二）金属螯和能力的测定

壳聚糖对金属螯合能力的影响结果见图5，从图中可以看出，EDTA表现出很强的螯合活性，在浓度为0.4 mg/ml时达到最大，为99.61%，随后略有下降。壳聚糖对金属的螯合能力总体来说低于EDTA，在0.2～1 mg/ml的浓度范围内，随着浓度的升高，呈上升趋势。

图4 壳聚糖对金属螯合能力的影响

三、讨论

本研究对虾蟹壳提取的壳聚糖抗氧化效果进行检测。结果表明，壳聚糖提取物对不同自由基的清除能力不同，壳聚糖浓度为0.5 mg/ml时，DPPH自由基清除率为80%左右，超氧阴离子自由基清除率为20%左右。并且低浓度壳聚糖提取物对自由基的清除能力较低，壳聚糖浓度达2.5 mg/ml时超氧阴离子自由基清除率仅为约40%，羟自由基清除率仅为约30%。周元敬等人表示壳聚糖对自由基的清除效率随着壳聚糖浓度的增大而升高，与本实验研究结果相同。Je等人经研究表示，5～1 kDa的壳聚糖在3 mg/ml时可清除95%以上的DPPH自由基，且自由基的清除率随着壳聚糖相对分子质量的增大而降低，因此从废弃虾蟹壳内提取出的壳聚糖分子量尚待进一步研究。

本实验中，从废弃虾蟹壳内提取出的壳聚糖浓度为2.5 mg/ml时金属螯合率即可达到80%左右，证明其具有较高的金属螯合能力，这与壳聚糖的结构有关。壳聚糖是一种天然高分子，在其分子结构的重复单元中存在氨基氮、羟基氧及N_乙酰氨基，由于这些基团的存在，使壳聚糖通过氢键或盐键形成具有类似网状结构的笼形分子，从而对金属离子有着稳定的配位作用，因而能同过渡金属离子形成配键而具有极强的螯合能力。

（略）