甘蔗脱毒健康种苗中蔗糖转化酶表达分析

王俊刚　赵婷婷　杨本鹏　蔡文伟　冯翠莲　曾军　熊国如　张树珍

摘要：甘蔗脱毒健康种苗能够有效提高植株生物量和糖分，而蔗糖转化酶则是甘蔗生长和蔗糖积累的关键酶。拟分析3种甘蔗蔗糖转化酶基因，即可溶性酸性转化酶（soluble acid invertase，简称SAI）、可溶性中性转化酶（neutral invertase，简称NI）和细胞壁酸性转化酶（cell wall-bound invertase，簡称CWI）基因在脱毒种苗、常规种苗全生育期的表达量差异。结果表明，细胞壁酸性转化酶主要在脱毒健康种苗拔节期未成熟叶片、茎及成熟期叶片、未成熟茎节中上调表达，尤其在成熟期未成熟茎节中大幅上调表达，促进茎节的快速生长和蔗糖的卸载及积累；液泡可溶性酸性转化酶SAI、可溶性中性转化酶主要在成熟期叶片和未成熟茎节中上调表达，有利于促进成熟期脱毒健康种苗茎秆中糖分积累及对单糖的快速利用。进一步研究表明，脱毒处理可以提高甘蔗生长后期蔗糖转化酶的表达量，有利于生物量和蔗糖含量的增加，可能是脱毒健康种苗增糖增产的分子调节机制之一。

关键词：甘蔗；脱毒健康种苗；蔗糖转化酶；表达量

中图分类号： Q9465；S566101文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）21-0035-04[

收稿日期：2016-06-08

基金项目：国家“863”计划（编号：2013AA102604-1）；海南省自然科学基金（编号：20163124）；中央级公益科研院所基本业务费（编号：ITBB140503）；现代农业产业技术体系建设专项资金（编号：CARS-20-2-5）。

作者简介：王俊刚（1983—），男，湖北孝感人，博士研究生，助理研究员，研究方向为甘蔗生物技术。Tel：（0898）66987509；E-mail：wangjungang@itbborgcn。

通信作者：张树珍，博士，研究员，研究方向为甘蔗生物技术。Tel：（0898）66987509；E-mail：zhangsz2007@163com。

甘蔗是禾本科甘蔗属多年生草本C4植物，是将光能转化为化学能效率最高的作物之一，是世界上重要的糖料作物和能源作物，约生产全球70%的食糖和42%的乙醇[1]。蔗糖是甘蔗生产的主要物质，其合成和积累过程是一个系统的调控网络，涉及到各种蔗糖代谢相关酶、转运蛋白及信号分子等的调节作用[2-3]，而蔗糖转化酶能够催化蔗糖的水解，影响茎秆蔗糖含量[4-5]。高等植物中含有多个编码蔗糖转化酶的基因，蔗糖转化酶既存在于光合组织中，也存在于非光合组织中，主要累积于细胞质、液泡和细胞间隙。高等植物中转化酶依据不同的溶解性、亚细胞定位和最适pH值，可以分为3种类型：（1）可溶性中性转化酶（neutral invertase，简称NI），为非糖基化形式，存在于细胞质中，最适pH值为中性或弱碱性（pH值70～80），在植物组织中降解蔗糖满足代谢中对己糖的需求；（2）可溶性酸性转化酶（soluble acid invertase，简称SAI），主要存在于液泡中，为糖基化形式，其活性最适pH值为酸性（45～50），参与调节光合同化产物在淀粉和蔗糖间的分配及控制蔗糖己糖比率[6-7]；（3）细胞壁酸性转化酶（cell wall-bound invertase，简称CWI），最适pH值为酸性（45～55），但有较高的pI值（9～10）。细胞壁转化酶则主要负责调节蔗糖从叶片（源）中输出的速率，是蔗糖源源不断地向库细胞卸载的重要动力[8-10]，促进植物细胞从源代谢向库代谢的转变，有助于库器官的生长和代谢产物的长距离运输[11-12]。

甘蔗多年宿根种植引起甘蔗品种退化，利用腋芽茎尖脱毒处理能够恢复母本性状，使甘蔗产量增加20%～40%，含糖量增加05～10百分点[13-15]，但是有关从分子生物学水平研究脱毒处理对蔗糖转化酶表达量的影响还未见报道。本研究以已报道的3个甘蔗蔗糖转化酶为研究对象，从甘蔗生长的苗期、分蘖期、拔节期和成熟期对其表达量进行比较分析，探讨脱毒处理与蔗糖转化酶表达量之间的关系，以便从分子生物学层面上分析脱毒处理对转化酶表达量的影响，揭示脱毒健康种苗可能的增产增糖机制。

1材料与方法

11试验材料

供试材料为新台糖22号品种腋芽脱毒健康种苗二代种茎苗和未脱毒新台糖22种茎，来源于中国热带农业科学院热带生物技术研究所甘蔗试验地。

12试验地点

试验地点设在海南省临高县皇桐镇国家甘蔗产业技术体系试验站，土壤为红壤，肥力中等。

13田间试验设计和管理

参照文献[15-16]的有关方法进行处理。

14总RNA提取、定量与完整性检测

取从10个完整植株剥离的冻存样品进行研磨，用TRIzol法提取RNA，TRIzol RNA提取试剂购自Aidlab （艾德莱）公司。用核酸分析仪（Eppendorf Biophotometer Plus）测定260、280 nm处的吸光度，以D260 nmD280 nm值估计总RNA的纯度，以D260 nm进行总RNA定量。用10%普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

15第一链cDNA的合成

取3 μg甘蔗总RNA与1μL反转录引物（10 pmolL）（Oligo-dT接头引物）混合，65 ℃加热5 min后，立即放置于冰上，然后加入5×buffer、25 mmolL dNTP混合液、40 UμL Ribonuclease Inhibitor、5 UμL M-MLV反转录酶，反应体系为 25 μL。反应过程如下：42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，5 min后瞬时离心，最后于-80 ℃保存备用。

16引物设计

根据公布的甘蔗蔗糖转化酶基因CWI（GenBank登录号：BU925833）、NI（GenBank登录号：KC145797）、SAI（GenBank登录号：AY302083） 序列，利用Primer5设计引物，内参GADPH基因引物参考文献[17]，详见表1。endprint