高效液相法同时测定饮品中8种食品添加剂

卫星华，李荣，董曼曼，艾芸，张亚锋，高安成

（西安市食品药品检验所，陕西西安710054）

高效液相法同时测定饮品中8种食品添加剂

卫星华，李荣，董曼曼，艾芸，张亚锋，高安成

（西安市食品药品检验所，陕西西安710054）

首次建立同时测定饮品中8种食品添加剂（苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜、脱氢乙酸、咖啡因、阿斯巴甜、纳他霉素）的高效液相色谱法。试验中，样品经水溶后，加入乙酸锌与亚铁氰化钾溶液沉蛋白处理，采用C18色谱柱，以甲醇和乙酸铵溶液（0.02 mol/L）为流动相进行梯度洗脱分离，流速1.0 mL/min，测定波长210 nm和305 nm，进样量10 μL。结果表明，在此条件下，8种组分得以完全分离，并呈良好线性关系，加标回收率为91%～102.5%，相对标准偏差为0.4%～2.7%。

高效液相色谱；食品添加剂；饮品

食品添加剂是为改善食品品质和色、香、味，以及为防腐、保鲜和加工工艺的需要而加入食品中的人工合成或者天然物质[1]。其与现代食品业的发展紧密相关，甚至在一定程度上可以衡量一个国家的食品安全技术和经济发展水平。但由于相对缺少针对食品添加剂的先进检测标准及合理监管模式，我国仍大量存在违法、超范围、超量使用问题。故建立快速有效的多成分同时测定法具有重大现实意义。目前，针对饮品中食品添加剂的检测除文献报道外[2-7]，已有相关国家标准[8-13]作为检测依据。但目标检测成分较为单一，且前处理方法繁琐，费时费力，效率低下。本试验建立了同时测定饮品中8种常用添加剂（纳他霉素、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、咖啡因、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜）的高效液相色谱法。该法前处理简单、便捷，准确度高，可为建立国家标准提供依据，有效的配合相关监管部门快速、准确的对饮品市场进行监控，增加公众对食品安全和食品添加剂的信心。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Ultimate3000高效液相色谱仪，配备二级管阵列（diode array，DAD）紫外可见光检测器：塞默飞世尔科技有限公司；Milli-Q纯化水机：密理博中国有限公司；Mettler Toledo ME204E、MS105电子分析天平：METTLER TOLEDO（上海）有限公司；KQ-700VDB型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；HC-2518高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司。

标准物质：苯甲酸（99.9%，Supelco）、山梨酸（99.9%，Supelco）、糖精钠（99.9%，Supelco）、安赛蜜（99.9%，Sigma）、脱氢乙酸（99．5%，Chemservice）、阿斯巴甜（99.0%，Supelco）、咖啡因（99.9%，ChramaDex）。

甲醇（色谱纯）：德国Merck公司；乙酸铵（分析纯）、乙酸锌（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；试验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

乙酸锌溶液：称取220 g乙酸锌溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，加水稀释至1 L。亚铁氰化钾溶液：称取106 g亚铁氰化钾加水溶解并定容至1 L。

1.2.2 对照品储备溶液的制备

分别精密称定苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、咖啡因对照品25 mg置25 mL容量瓶中，以水溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液，置于冰箱中冷藏保存。精密称定纳他霉素对照品约12.5 mg置25 mL容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液，置于冰箱中冷藏保存。

1.2.3 混合标准使用液的配制

分别用水将标准储备溶液稀释成含苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、咖啡因、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜为5、10、20、50、100μg/mL，纳他霉素为 2.5、5、10、25、50 μg/mL的混合标准溶液。

1.2.4 样品制备与提取

碳酸饮料、果汁及果酒、葡萄酒等液体样品：称取5.00 g样品于25 mL容量瓶中（如为含气饮料则超声去除二氧化碳，如含有酒精则需加热挥去酒精），用水定容至刻度，混匀，过0.45 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

乳饮料、植物蛋白饮料等液体样品：称取5.00 g样品于25 mL容量瓶中，加水10 mL，超声10 min，加入2 mL乙酸锌溶液与2 mL亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白，加水定容至25 mL并混匀。将样品转移入离心管中，以5 000 r/min，离心5 min，取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤后，作为供试品溶液。

1.2.5 色谱条件

色谱柱：Agela Venusil ASB C18，4.6 mm×250 mm，5μm。柱温：30℃。进样量：10μL。流速：1 mL/min。流动相：甲醇-0.02 mol/L乙酸铵溶液。梯度洗脱程序：0～17 min，8%甲醇；17 min～22 min，8%～40%甲醇；22 min～30 min，40%甲醇；30 min～34 min，40%～70%甲醇；34 min～45 min，70%甲醇。检测波长：0～32 min，210 nm；32 min～45 min，305 nm。

1.2.6 样品的测定

精密吸取供试品溶液10 μL进样，按1.2.5项下条件进行分析，以保留时间定性，根据外标法以峰面积定量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对8种添加剂在190 nm～400 nm之间进行三维光谱扫描，纳他霉素、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜、脱氢乙酸、咖啡因、阿斯巴甜的最大吸收波长分别在 304、224、254、203、227 、231、204、203 nm处。经过反复试验，综合考虑到各组分的灵敏度、基体干扰等因素，最终选定苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜、脱氢乙酸、咖啡因、阿斯巴甜的检测波长为210 nm，纳他霉素的检测波长为305 nm，在此波长条件下，8种食品添加剂分离度效果好、基线稳定、灵敏度高、稳定性好。

2.1.2 流动相的选择

甲醇和乙酸铵溶液流动相是目前国标方法测定食品添加剂最常用的流动相之一，因其通用性好，故选择以甲醇为流动相A，0.02 mol/L乙酸铵溶液为流动相B。经试验证明，按梯度洗脱，0～17 min，8%甲醇；17 min～22 min，8%～40%甲醇；22 min～30 min，40%甲醇；30 min～34 min，40%～70%甲醇；34 min～45 min，70%甲醇，各组分均可完全分离，且峰形对称，无杂质峰干扰。因此，选择甲醇-0.02 mol/L乙酸铵溶液为流动相，按上述梯度洗脱程序进行分离。在此条件下，8种物质能够很好地分开，峰型好，纳他霉素、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、咖啡因、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜色谱图见图1。

2.2 方法线性关系、精密度和检出限

按试验方法对混合标准溶液系列进行测定，以峰面积对质量浓度进行线性回归，绘制标准曲线。各食品添加剂的线性范围、线性回归方程、相关系数、精密度（n=6）及检出限（S/N=3）见表1。

图1 混合标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed pesticide standards

表1 线性关系、精密度及检出限Table 1 Linear relationship，accuracy and detection limit of this method

2.3 样品加标回收率

对饮料样品按上述方法进行低、中、高3水平加标回收试验，按上述方法进行回收率试验，计算8种添加剂的平均回收率和相对标准偏差，结果见表2。

表2 8种物质的回收率试验结果（n=6）Table 2 Results of the recovery rate of 8 components（n=6）

续表2 8种物质的回收率试验结果（n=6）COntinue table 2 Results of the recovery rate of 8 components（n=6）

由表2可知，8物质的加标回收率在91%～102.5%之间，测定结果的相对标准偏差为0.6%～2.0%，准确度符合实际样品的检测要求。

2.4 样品测定

按该试验方法及国标方法对市售8种饮料样品分别进行测定，其中安赛蜜使用国家标准GB/T 5009.140-2003《饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》，苯甲酸、山梨酸、糖精钠使用国家标准GB/T 23495-2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定高效液相色谱法》，脱氢乙酸使用国家标准GB/T 23377-2009《食品中脱氢乙酸的测定高效液相色谱法》，咖啡因使用国家标准GB 5009.139-2014《食品安全国家标准饮料中咖啡因的测定》，阿斯巴甜使用国家标准GB/T 22254-2008《食品中阿斯巴甜的测定》，纳他霉素使用国家标准GB/T 21915-2008《食品中纳他霉素的测定液相色谱法》，结果见表3。

本方法测定值与国标方法测定值精密度在0～3%之间，测定结果表明本试验方法准确度高，符合检测要求，达到日常测定样品的要求。

3 结论

本方法建立了高效液相色谱法同时测定饮品中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、咖啡因、纳他霉素、脱氢乙酸和阿斯巴甜8种添加剂的检测方法。试验在210 nm和305 nm的紫外检测波长下，采用甲醇和乙酸铵流动相体系进行梯度淋洗，8种添加剂得到基线分离。结果表明，该方法操作简单便捷、灵敏度高、精密度好、准确度高，符合检测要求，适用于试验室中大批量样品的检测。

表3 实际样品的测定结果Table 3 Determination results for real samples

[1]中华人民共和国卫生部．GB 2760-2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准[S]．北京:中国标准出版社,2014

[2]宋戈,鄂来明,单艺．高效液相色谱法测定乳及乳制品中4种人工合成甜味剂[J]．理化检验-化学分册,2011,47(2):150-153

[3]蔡志斌,张英,刘丽．超高液相色谱法同时测定冷饮中12种食品添加剂[J]．实用预防医学,201l,18(1):138-141

[4]张丽平,蒋旎．国标法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠的分析探讨[J]．中国调味品,2014,39(5):108-110

[5]杭莉．高效液相法同时测定葡萄酒中3种防腐剂和2种甜昧剂[J]．中国酿造,2014,33(6):144-146

[6]尤妍,潘辉国,陈盼盼,等．高效液相色谱法同时测定饮料5种添加剂[J]．食品研究与开发,2016,37(4):164-166

[7]李英,栾丽英．HPLC法测定火腿肠中山梨酸、苯甲酸提取条件优化[J]．食品研究与开发,2017,38(4):133-137

[8]中华人民共和国卫生部．GB/T 23495-2009食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定高效液相色谱法[S]．北京:中国标准出版社,2009

[9]中华人民共和国卫生部．GB/T 5009.140-2003饮料中乙酰磺胺酸钾的测定[S]．北京:中国标准出版社,2003

[10]中华人民共和国卫生部．GB/T 22254-2008食品中阿斯巴甜的测定[S]．北京:中国标准出版社,2008

[11]中国人民共和国卫生部．GB/T 23377-2009食品中脱氢乙酸的测定高效液相色谱法[S]．北京:中国标准出版社,2009

[12]中国人民共和国卫生部．GB/T 21915-2008食品中纳他霉素的测定液相色谱法[S]．北京:中国标准出版社,2008

[13]中国人民共和国卫生部．GB 5009.139-2014食品安全国家标准饮料中咖啡因的测定[S]．北京:中国标准出版社,2014

Determination of Eight Food Additives in Drink by HPLC

WEI Xing-hua，LI Rong，DONG Man-man，AI Yun，ZHANG Ya-feng，GAO An-cheng
（Xi'an Institute for Food and Drug Control，Xi'an 710054，Shaanxi，China）

A HPLC （High Performance Liquid Chromatography）method for determination of eight food additives （benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium，acesulfame potassium，dehydroacetic acid，caffeine，aspartame，natamycin）in drink was developed．After sample pretreatment，adding zinc acetate and potassium ferrocyanide，separated by C18chromatographic column，using gradient elution of methanol and ammonium acetate（0.02 mol/L），with the flow rate of 1.0 mL/min.The determination wavelength was 210 nm and 305 nm，sample size 10 μL.Under these conditions，the 8 components can be separated completely and show good linear relationship.The standard recovery rate was in the range of 91%-102.5%and the relative standard deviation was 0.4%-2.7%.

HPLC；food additives；drink

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.027

陕西省食品药品快速检测公共服务平台建设（2014FWPT-01）

卫星华（1982—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：食品分析。

2017-05-18