双酶分步水解低值海洋鱼粉制备低聚肽的研究

丁树慧，王立梅，齐斌，张晶

（1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春130118；2.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

双酶分步水解低值海洋鱼粉制备低聚肽的研究

丁树慧1，2，王立梅2，齐斌2，张晶1，*

（1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春130118；2.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

为了得到更多的低聚肽，分析比较碱性蛋白酶、中性蛋白酶等多种蛋白酶对低值海洋鱼粉的酶解效果，以水解度为指标，筛选出中性蛋白酶和碱性蛋白酶为最佳水解酶，并通过响应曲面分析法优化酶解工艺。结果表明：最优酶解条件为：碱性蛋白酶与中性蛋白酶酶活力配比为6∶4先后加入，总加酶量为2 500 U/g，pH值为8时碱性蛋白酶酶解2 h，pH值降为7时中性蛋白酶酶解3 h，酶解温度为50℃，该条件下水解度高达41.84%。

低值海洋鱼粉；蛋白酶；双酶酶解；响应面分析

全球约有一半生物来自于海洋，其也是功能成分多样性生物的丰富来源[1]。过去几十年来，许多传统鱼种存储量大幅度减少，海洋物种过度开发的比例增加，造成了世界海洋渔业严重恶化的状态[2-3]。此外，人口的增长和对健康海洋食品消费意识的提高，增加了对鱼类和鱼副产物的需求，但许多几乎没有商业利益的非目标物种仍未得到充分利用[4]，一般加工成鱼粉，用于饲料、肥料等低附加值的产品[5-6]。如何开发这些量大质低的鱼类，提高低值鱼粉的营养价值和生物活性[7-8]，对于我国经济和社会发展有着重要意义。

随着酶技术的发展，酶法水解在水产加工利用中的应用越来越广泛[9-10]。不仅可以提高未充分利用鱼类资源的利用率[11]，而且能够释放肽类改善生物活性[12-15]。单酶水解是以往研究最常用的方法，但水解效果通常不太理想，蛋白质很难被彻底水解，水解率较低，生产效益低下[16-17]，双酶酶解则因其良好的水解效果而得到人们的广泛关注[18-20]。

低值海洋鱼粉的蛋白质含量占50%～70%，消化率高达90%，氨基酸平衡，富含维生素B和矿物质，水解液中含有较丰富的具有特殊生理活性的功能性肽。目前，市场上的蛋白酶耐受盐浓度较低，在酶解含盐浓度较高的鱼粉时，水解度较低。因此，开发海洋低值鱼粉低聚肽，蛋白酶的选择重中之重。本试验利用低值海洋鱼粉进行酶催化反应，筛选出最佳蛋白酶，通过响应面分析法优化酶解工艺条件，获得较多的低聚肽，提高资源利用率和经济价值，丰富低值海洋鱼粉的功能食品开发和利用。

1 材料与方法

1.1 材料

脱脂海洋鱼粉：中海海洋科技有限公司（青岛，中国）。

碱性蛋白酶（Alcalase，2×105U/g）、中性蛋白酶（Neutral，8×105U/g）、复合蛋白酶（Protamex，1.07×105U/g）、风味蛋白酶（Flavourzyme，2.85×105U/g）：诺维信生物技术有限公司；木瓜蛋白酶（Papain，8×105U/g）、胰蛋白酶（Trypsin，2.5×106U/g）：上海西宝生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯：上海国药集团。

1.2 仪器与设备

酸度计（EL-20K）：上海梅特勒仪器厂；定氮仪（KND-2C）：上海纤检仪器有限公司；数显恒温水浴锅（HH-4）：常州国华电器；高速冷冻离心机（CR22G-Ⅱ）：日本日立公司；磁力加热搅拌器（CL-2）：上海豫康科教有限公司；超低温冰箱（Heto）：美国Thermo电气公司；真空冷冻干燥机：德国CHRIST公司；电子天平（FA604A）：上海精天电子仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 脱脂鱼粉酶解工艺流程

脱脂海洋鱼粉→加去离子水→加酶→调pH值→恒温水解→100℃灭酶15 min→冷却→10 000 r/min离心15 min→取上清液→冷冻干燥→多肽成品

1.3.2 最适蛋白酶的筛选

称取适量鱼粉，按照料液比为1∶10（g/mL）加入去离子水，在恒温水浴中不断搅拌，分别加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，加酶量都为2 500 U/g，在各自最适酶解温度和pH值下，酶解6 h，每隔1 h取水解液测定水解度，见表1所示。

表1 低值海洋鱼粉的酶解参数Table 1 Parameters for enzymatic hydrolysis of low-value marine fish meal

1.3.3 双酶酶解最佳条件的确定

筛选出水解度较高的两种蛋白酶，将酶解条件统一为：总加酶量 2 500 U/g，料液比 1 ∶10（g/mL），在各自温度、pH值下，酶解5 h，研究先后加入和同时加入不同加酶方式对酶解效果的影响。

1.3.4 单因素的优化

以蛋白质水解度为衡量指标，对影响酶解反应的主要因素如加酶量、pH值、温度、酶解时间、酶活力配比进行研究，确定最佳酶解工艺。

1.3.5 响应面优化试验

综合考虑实际生产的需要，在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken试验，选取加酶量、酶解时间、pH值和酶解温度4个因素，以水解度为响应值，进一步优化低值海洋鱼粉的酶解条件。

1.4 肽分子量分布

采用高效凝胶过滤色谱法测定[21]。鱼粉酶解产物溶于去离子水中，离心，微孔过滤膜过滤后上TSK gel 2000 SWXL，流动相为乙腈和水，流速0.5 mL/min，温度30℃，波长为220 nm。以细胞色素C、抑肤酶、杆菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸为标准品做相对分子质量校正曲线。

1.5 数据分析

本研究运用Design expert8.06软件进行中心点试验设计和方差分析，试验数均以x±s表示。各组数据均数间用t检验判断其差异显著性。p＜0.05为显著性差异，p＜0.01为极显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 最适蛋白酶的筛选

Aluko等[22]指出生物活性肽的活性与其分子量大小、末端氨基酸的种类有关，且不同蛋白酶具有不同的酶切位点和反应条件[23]，决定了水解肽键的数量和位置，使酶解产物有着不同的生理活性，因此酶的选择尤为重要，其决定了产物的组成、风味、功能等性质。在本试验中，以低值海洋鱼粉为底物，选择碱性、中性、复合、风味蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶为水解反应催化剂，在酶各自最适温度、pH值下进行酶解，6 h后试验结果如图1。

由图1可知，水解度随时间而增加，5 h后渐渐趋于平缓。其中，碱性蛋白酶和中性蛋白酶水解度相差不太大，但都高于其他4种蛋白酶。由于蛋白酶具有专一性[24]，单酶水解时，只能从几个固定的氨基酸残基处进行水解，水解程度会受到一定程度的限制，水解产生的肽片段的末端氨基酸也较为单一。为得到分子量更小和活性更好的水解产物，选用碱性蛋白酶和中性蛋白酶两种酶。

图1 低值海洋鱼粉各蛋白酶酶解产物的水解度Fig.1 The hydrolysis degree of all protease enzymolysis products from low-value fish meal

2.2 双酶分步酶解最佳工艺的研究

2.2.1 分步酶解最佳条件的确定

选用水解度较高的酶制剂碱性蛋白酶①和中性蛋白酶②，统一酶解条件为：总加酶量为2 500 U/g，酶解时间为5 h，在各酶最适温度和pH值下，不同酶解方案和参数见表2。

表2 双酶水解低值鱼粉蛋白的不同酶解方案及结果Table 2 Different programs and results for composite enzymatic hydrolysis of low-value fish meal proteina

由表2可知，以碱性蛋白酶和中性蛋白酶先后加入方式水解度最高，达到（39.35±0.32）%。说明这种方案优于其他方式，在后续试验中即选用中性蛋白酶和碱性蛋白酶先后加入方式。

2.2.2 单因素试验

2.2.2.1 总加酶量对水解效果的影响

总加酶量对水解效果的影响见图2。

由图2可知，随着加酶量的增加水解度逐步增加，但在总加酶量大于2 500 U/g时，水解度渐渐下降，可能因为开始加酶量低，酶和底物能够完全结合；当酶量大于最适浓度时，酶分子过于饱和，有些酶分子未能与蛋白质结合，所以水解度不会有太大变化[25-26]。结合试剂最大利用率和实际成本，选用2 500 U/g。

图2 总加酶量对低值鱼粉蛋白水解度的影响Fig.2 Effect of total enzyme dose on DH of low-value fish meal protein

2.2.2.2 两种酶活力配比对水解效果的影响

两种酶活力配比对水解效果的影响见图3。

图3 碱性和中性蛋白酶酶活力配比对低值鱼粉蛋白水解度的影响Fig.3 Effect of enzyme activity ratio of alcalase and neutrase on DH of low-value fish meal protein

由图3可知，随着碱性蛋白酶的比例增加，水解度不断增加，在碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶活力配比为6∶4（U/mg）时，水解度达到最高，高达 42.02%。

2.2.2.3 酶解时间对水解效果的影响

酶解时间对水解效果的影响见图4。

图4 酶解时间对低值鱼粉蛋白水解度的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on DH of low-value fish meal protein

由图4可见，水解度随时间的增加而增加，但在5h之后水解速率开始下降。可能是因为随着酶解反应的进行，底物浓度减小，反应位点逐渐被酶分子饱和，产物浓度增大，反应竞争性抑制加强，酶活力下降，中间复合物经过初始阶段的积累达到稳态，逐渐恒定[27]。综合考虑，适宜的酶解时间为5 h。

2.2.2.4 pH值对水解效果的影响

pH值对水解效果的影响见图5。

图5 酶解pH值对低值鱼粉蛋白水解度的影响Fig.5 Effect of pH value on DH of low-value fish meal protein

由图5可知，碱性和中性蛋白酶的pH值都是先上升后下降，可能是因为pH值的不断上升使酶活力降低，酶与底物的结合能力下降。故本试验中中性蛋白酶最适pH值为7.0，碱性蛋白酶最适pH值为8.0。

2.2.2.5 温度对水解效果的影响

温度对水解效果的影响见图6。

图6 酶解温度对低值海洋鱼粉蛋白水解度的影响Fig.6 Effect of temperature on DH of low-value fish meal protein

由图6可知，在一定温度范围内，水解度随温度的上升而增加，在50℃时水解度达到最大值；此阶段，温度增加可以提高底物分子的热能，从而使反应的速率加大，水解度也随之增加。当温度超过50℃后，水解度急剧下降，这是因为酶本身是蛋白质，温度逐渐上升造成酶蛋白变性失活，从而影响水解度，使之降低。故双酶分步酶解的最适温度为50℃。

2.2.3 响应面试验分析双酶分步水解低值鱼粉

2.2.3.1 分析因素的选取

考虑到各因素之间的交互影响，结合2.2.2节单因素试验结果，为了得到最佳反应条件，对加酶量、酶解pH值、时间和温度4个因素进行响应面优化，四因素三水平共29个试验点，其中24个析因点，5个中心点，试验因素水平设计见表3。

表3 低值海洋鱼粉蛋白响应面分析法因素水平表Table 3 Factors and levels of low-value fish meal protein in response surface design

2.2.3.2 方差分析及响应曲面分析图

方差分析见表4，各因素间的相关性对水解度的影响见图7。

表4 水解度回归方程方差分析Table 4 ANOVA for regression equation of DH

图7 各因素间的相关性对水解度的影响Fig.7 Response surface plots showing the pairwise interactive effects of four hydrolysis conditions on the DH

由表4可知，二次回归模型的F值为71.16，大于0.01水平上的临界值，P值＜0.000 1，失拟项的F值为2.38＞0.05，差异不显著，说明未知因素对试验干扰很小，方程没有失拟因素存在，回归方程相关系数R2=0.986 1，说明回归方程拟合的较好，可用回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析[29]。将回归方程的各项回归系数进行 t检验，发现 B、AD、BC、A2、B2、C2、D2因素非常显著（P＜0.01），说明各因素对酶解参数有交互作用，不是简单的线性关系。

根据回归系数，对响应面结果进行多元回归拟合，得到相应回归方程：

从图7分析可知，pH值对水解度的影响最为显著，表现为曲线最陡；时间的影响次之，而图中温度曲线最平滑，因此影响最不显著。时间和温度、pH值和时间两者之间的交互作用显著，温度与pH值的交互作用次之，而其它因素两者之间的交互作用不太明显。

2.3 分子量分布

分子量分布图见图8所示。

图8 低值海洋鱼粉的分子量分布Fig.8 Molucular weight distribution of low-value fish meal oligopeptide

图8体现了通过酶法水解低值海洋鱼粉后大多数大分子蛋白质转化为小分子寡肽。分子量在180 Da～1 000 Da范围的高达（91.09±0.23）%，值得一提的是，二肽和三肽比例占（58.90±0.48）%，分子量大于10 000 Da的蛋白质只占（0.29±0.03）%。

3 结论

试验以低值海洋鱼粉为原料，以水解度为指标，采用蛋白酶酶解技术制备鱼粉多肽。通过单因素试验和Box-Behnken试验及响应面的分析优化碱性蛋白酶和中性蛋白酶双酶酶解鱼粉工艺条件。确定最佳酶解条件为：加入pH值为8的碱性蛋白酶酶解2 h，pH值降到7时再加入中性蛋白酶，酶解3 h，酶解温度50℃，加酶量为2 500 U/g。分子量分布主要在180 Da～1 000 Da范围内，大分子蛋白质水解彻底。

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The Study of Oligopeptides from Low-value Marine Fish Meal with Double Enzyme Hydrolysis

DING Shu-hui1，2，WANG Li-mei2，QI Bin2，ZHANG Jing1，*
（1.College of Chinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.School of Biotechnology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

In order to get more oligopeptides，establish low-value marine fish meal hydrolysis conditions，degree of hydrolysis as the indexes to compare the effect of hydrolysis of alkaline protease，neutral protease and so on the many kinds of protease.Alkaline protease and neutral protease was selected as the best protease.The hydrolysis conditions was optimized by response surface methodology.The results showed the optimal enzymatic hydrolysis conditions：the alkaline protease and neutral protease enzyme activity ratio of 6 ∶4 successively joined，enzyme amount was 2 500 U/g，the alkaline protease kept hydrolyzing for 2 h when the pH was 8.Until the pH value dropped to 7.0，the neutral protease was added and continued stirring for another 3 h，enzymolysis temperature 50℃.Under the condition of the hydrolysis degree as high as 41.84%.

marine low-value fish meal；protease；double enzyme hydrolysis；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.009

国家高技术研究发展计划项目（863计划）（2013AA102203-03）；江苏省科技厅重点研发计划（BE2017316）；江苏省科技厅重点研发计划（BE2017326）

丁树慧（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

*通信作者：张晶（1971—），女（汉），教授，博士，研究方向：中药化学。

2017-05-16