苗药透骨香的质量标准研究Δ

姚成芬，张宝，熊丹丹，刘亭，郑林，李月婷，陈青凤，李勇军（1.民族药与中药开发应用教育部工程研究中心/国家苗药工程技术研究中心，贵阳 550004；2.贵州医科大学药学院，贵阳 550004；.贵州省药物制剂重点实验室，贵阳 550004）

苗药透骨香的质量标准研究Δ

姚成芬1，2＊，张宝1，2，熊丹丹1，2，刘亭3，郑林3，李月婷3，陈青凤1，2，李勇军1#（1.民族药与中药开发应用教育部工程研究中心/国家苗药工程技术研究中心，贵阳 550004；2.贵州医科大学药学院，贵阳 550004；3.贵州省药物制剂重点实验室，贵阳 550004）

目的：建立透骨香药材的质量标准。方法：采用薄层色谱法（TLC）对药材进行定性鉴别；测定药材水分、总灰分和酸不溶性灰分；采用高效液相色谱法测定药材中水杨酸甲酯的含量：色谱柱为Eclipse XDB-C18，流动相为甲醇-水（62∶38，V/V），流速为1.0 mL/min，检测波长为307 nm，柱温为30℃，进样量为10µL。结果：药材的TLC图斑点清晰，分离度好。药材水分为8.2%～10.8%，总灰分为0.9%～4.0%，酸不溶性灰分为0.1%～0.9%。水杨酸甲酯检测进样量线性范围为0.045～0.73 μg（r＝0.999 9）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤1.0%；水杨酸甲酯加样回收率为97.8%～104.3%（RSD＝2.6%，n＝9）。结论：该研究所建标准可用于透骨香药材的质量控制。

透骨香；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量标准；滇白珠苷A；水杨酸甲酯

透骨香为杜鹃花科植物滇白珠Gaultheria yunnanensis（Franch.）Rehd.的干燥全株[1]，为2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》收载品种[2]，具有清热解毒、活血化淤、祛风湿、顺气平喘的功效，临床主要用于风湿性关节炎、眩晕、闭经、风寒感冒等疾病的治疗[3-6]。现代药理研究表明，透骨香药材有抗炎、镇痛和抗菌等作用[7-9]。现代化学研究表明，透骨香药材含有黄酮类、木脂素类、挥发油类、萜类、有机酸类、甾体类等化学成分[10-13]。目前，药材标准中仅有性状和显微鉴别，其质量标准不够完善。本课题组在前期研究的基础上，采用2015年版《中国药典》[14]中附录及相关方法，采集33批不同产地的透骨香药材，对其进行质量标准研究，为该药材质量标准的提高和修订提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-10Avp型高效液相色谱（HPLC）仪，包括LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外检测器、7725i手动进样阀、TC-100柱温箱、WML色谱工作站、UV-2401PC紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；TCQ-250型超声波清洗器（北京医疗设备二厂）；AE240型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；GZX-9420 MBE型电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 试剂

滇白珠苷A对照品（贵州省药物制剂重点实验室自制，质谱检测确定结构，HPLC测定纯度＞98%）；水杨酸甲酯对照品（批号：110707-200609，纯度：≥98%）、透骨香对照药材（批号：121292-200402）均购于中国食品药品检定研究院；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

透骨香药材采于贵州省各地（见表1），经贵州医科大学生药学教研室龙庆德副教授鉴定为真品。

表1 透骨香药材来源Tab 1 Source of G.yunnanensis

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

取药材样品粉末（过40目筛）1 g，置于量瓶中，加甲醇25 mL，超声（功率：200 W，频率：29 kHz）提取30 min，提取液直接流穿上已处理好的聚酰胺（30～60目，1 g）柱，用75 mL乙醇洗脱，收集流穿液与乙醇洗脱液，蒸干，残渣加2 mL甲醇使溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取滇白珠苷A对照品，加甲醇制成滇白珠苷A质量浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液。再取对照药材1 g，同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按薄层色谱法[2015年版《中国药典》（四部）][14]试验，吸取上述3种溶液各6 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲苯-甲醇-醋酸（9∶1∶1∶0.5，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光灯下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点，详见图1。

2.2 水分检查

按2015年版《中国药典》（四部）水分测定法[14]测定药材样品水分。结果表明，33批药材样品水分为8.2%～10.8%（见表2）。拟定透骨香药材水分不得过11.0%。

图1 薄层色谱图Fig 1 TLC chromatograms

表2 药材样品水分、总灰分、酸不溶性灰分测定结果（n＝3，%）Tab 2 Content determination of moisture，total ash and acid insoluble ash in samples（n＝3，%）

2.3 总灰分和酸不溶性灰分检查

按2015年版《中国药典》（四部）灰分测定法[14]测定药材样品总灰分和酸不溶性灰分。结果表明，33批药材样品总灰分为0.9%～4.0%，酸不溶性灰分为0.1%～0.9%（见表2）。拟定透骨香药材总灰分不得过4.0%，酸不溶性灰分不得过1.0%。

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Eclipse XDB-C1（8150 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇-水（62∶38，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：307 nm；柱温：30℃；进样量：10µL。在上述色谱条件下，理论板数按水杨酸甲酯峰计＞4 000；分离度＞1.5，各成分基线分离良好，详见图2。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取水杨酸甲酯对照品11.36 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

图2 高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms

2.4.3 供试品溶液的制备 精密称取药材样品粉末（过20目筛）约0.6 g，置于量瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流2 h，冷却至室温，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，混匀，取上清液，经0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 线性关系考察 分别精密量取“2.4.2”项下对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL，分别置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列对照品溶液。精密量取上述系列对照品溶液各10 μL，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以水杨酸甲酯进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得水杨酸甲酯回归方程y＝2.85×104x－3.99×10（3r＝0.999 9）。结果表明，水杨酸甲酯检测进样量线性范围为0.045～0.73 μg。

2.4.5 精密度试验 取“2.4.2”项下对照品溶液适量，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，水杨酸甲酯峰面积的RSD＝0.4%（n＝9），表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 取“2.4.3”项下供试品溶液（编号：1）适量，分别于室温下放置0、1、2、4、8 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，水杨酸甲酯峰面积的RSD＝1.0%（n＝5），表明供试品溶液室温放置8 h内基本稳定。

2.4.7 重复性试验 精密称取样品（编号：1）适量，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，共9份，再按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，水杨酸甲酯含量平均值为0.92 mg/g，RSD＝0.8%（n＝9），表明本方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验 取已知含量药材样品（编号：1）适量，共6份，分别加入低、中、高质量的水杨酸甲酯对照品，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.4.9 药材样品含量测定 取33批药材样品各适量，分别按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算药材样品含量，结果见表4。

表3 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

表4 药材样品含量测定结果（n＝3，%）Tab 4 Results of content determination of samples（n＝3，%）

3 讨论

2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中透骨香药材使用部位为全株，透骨香药材主要用于治疗风湿性关节炎。研究表明，滇白珠苷A具有抗关节炎的药理活性[15]，该药理活性符合透骨香药材的主治功能，即滇白珠苷A为透骨香药材的有效成分。因此，本研究将滇白珠苷A作为药材样品的TLC定性鉴别研究的对照品，建立透骨香药材TLC的定性鉴别。通过TLC鉴别结果可知，透骨香药材起作用的部位可能为根和茎，叶是否有药效有待进一步研究。

文献报道，透骨香药材挥发油成分主要为水杨酸甲酯，其测定方法多用气相色谱法[16]，少数用TLC法和荧光分析法[17]。TLC法分离度低，操作复杂；荧光法前处理较烦琐。本研究采用HPLC法测定水杨酸甲酯的含量，优点在于处理简单，操作简单，重复性好。

综上所述，本研究所建标准可用于透骨香药材的质量控制。

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Study on Quality Standard of Miao Medicine Gaultheria yunnanensis

YAO Chengfen1，2，ZHANG Bao1，2，XIONG Dandan1，2，LIU Ting3，ZHENG Lin3，LI Yueting3，CHEN Qingfeng1，2，LI Yongjun1（1.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicines and Traditional Chinese Medicine，Ministry of Education/State Center for Miao Medicine Engineering Technology Research，Guiyang 550004，China；2.School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；3.Guizhou Provincial Key Lab of Pharmaceutics，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard for Gaultheria yunnanensis.METHODS：TLC was adopted for qualitative identification of samples.Moisture，total ash and acid-insoluble ash were determined.HPLC method was used to determine the content of methyl salicylate.The determination was performed on Eclipse XDB-C18column with mobile phase consisted of methanol-water（62∶38，V/V）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 307 nm，and column temperature was 30 ℃.The sample size was 10 μL.RESULTS：TLC spots of samples were clear and well separated.The moisture was 8.2%-10.8%，total ash was 0.9%-4.0%and acid-insoluble ash was 0.1%-0.9%.The linear range of methyl salicylate were 0.045-0.73 μg（r＝0.999 9）.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were no more than 1.0%.The recoveries of methyl salicylate were 97.8%-104.3%（RSD＝2.6%，n＝9）.CONCLUSIONS：The established standard can be used for quality control of G.yunnanensis.

Gaultheria yunnanensis；TLC；HPLC；Quality standard；Gaultheroside A；Methyl salicylate

R917

A

1001-0408（2017）33-4711-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.28

贵州省优秀科技人才项目（No.黔科合人字〔2015〕11）；贵州省协同创新中心建设项目（No.黔教合协同创新字〔2013〕04）；贵州省研究生卓越人才计划项目（No.ZYRC2014012）；贵州省科技计划项目（No.黔科合平台人才〔2016〕5613、黔科合平台人才〔2016〕5677）

＊硕士研究生。研究方向：中药药效物质基础及质量控制。E-mail：1340642402@qq.com

#通信作者：教授，硕士生导师。研究方向：中药药效物质基础及质量控制。E-mail：liyongjun026@126.com

（编辑：张 静）

2017-03-07

2017-04-16）